带鱼蛋白水解肽制备条件优化

王晓玲*，张芹，张洪芳，贺延茏，韦素贞

1. 威海海洋职业学院食品工程系（荣成 264300）；2. 威海市水产学校（荣成 264300）

带鱼（Hairtail）是我国盛产的四大经济鱼种之一，在我国的黄海、东海、渤海一直到南海都有分布。在带鱼加工过程中产生的下脚料占带鱼质量的1/2以上[1-2]，这些下脚料中含有丰富的优质蛋白资源，若随意丢弃不仅浪费资源，还会污染环境，故有效利用带鱼下脚料便成为研究热点。

试验以带鱼下角料为原料，经木瓜蛋白酶酶解得带鱼蛋白水解肽，利用单因素试验及正交试验优化水解条件，为优化带鱼蛋白水解肽-金属配合物的制备条件做基础研究，并为后期研究带鱼蛋白水解肽-金属配合物脱除重金属活性研究准备，以期建立一种高效、经济、环保脱出重金属的方法[3-4]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

带鱼下脚料，购于浙江舟山兴业公司，将带鱼经碎肉粉碎机粉碎后，分装成100 g/袋，于-18 ℃冰箱冷冻保存，使用前于4 ℃冰箱解冻24 h。

1 000 U/mg木瓜蛋白酶，上海金穗生物科技有限公司；溴酚蓝，分析纯，天津市福晨化学试剂厂；盐酸（HCl）、氢氧化钠（NaOH）、抗坏血酸、乙酸钠及三氯甲烷（CHCl3），分析纯（AR），国药集团化学试剂有限公司；试验过程中所使用的水皆为去离子水。

1.2 仪器与设备

BCD-190 NIM型冰箱，苏州三星电子；PHS-3 C型pH计，上海晶磁仪器有限公司；HWS-12型电磁恒温水浴锅，上海齐欣科学仪器有限公司；85-2型恒温磁力搅拌器，常州国华电器有限公司；HZ-8812 S型水浴恒温振荡器，太仓华利达仪器有限公司；CR 21 G型冷冻离心机，日本日立公司；BSA 323 S型电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；FSH-2型可调高速匀浆机，常州国华电器有限公司。

1.3 带鱼蛋白水解肽的制备

取20 g解冻好的带鱼下脚料，加入200 mL去离子水，匀浆后调节pH为6.5，在45 ℃下保温10 min。按带鱼下脚料质量加入适量的木瓜蛋白酶，在一定温度下进行酶解，酶解过程中不断搅拌，并且每隔2 h调节pH。酶解结束后，于90 ℃水浴灭酶10 min，混合液在4 ℃下以5 000 r/min离心20 min，除去上层油膜和下层沉淀即为带鱼蛋白水解肽。酶解条件由试验探究优化得出。

1.4 水解度的测定

水解度的测定方法有多种，常用的有茚三酮法、三氯乙酸法、甲醛滴定法等方法。茚三酮法比色时读数不稳定，三氯乙酸法酸溶蛋白中含有水解之前的蛋白质，导致这两种方法结果偏差较大，故试验采用甲醛滴定法。计算公式：DH=（h-h0）/htot。式中：h为带鱼蛋白酶解液中的—COOH或—NH基团的含量（mmol/g），h0为未经木瓜蛋白酶水解的带鱼原料中的—COOH或—NH基团的含量（mmol/g），htot为每克带鱼蛋白的肽键毫摩尔数（mmol/g），经测定分析，带鱼的htot=8.17 mmol/g[5-6]。

2 结果与分析

2.1 加酶量对酶解效果的影响

木瓜蛋白酶占带鱼的质量分数对酶解效果影响很大。一般说来，加酶量越大，酶解的效率越高，但加酶量过大不仅浪费，还会影响酶解效果，产生苦味氨基酸[7]。在料液比1∶10 g/mL、pH 6.5、酶解温度50 ℃、酶解时间8 h条件下，木瓜蛋白酶添加量对酶解效果的影响，如图1所示。当木瓜蛋白酶添加量为0.012%～0.020%时，酶解度呈不断增加趋势，最高达到66.24%；当超过0.020%时，增加趋势不显著（p＞0.05）。所以，木瓜蛋白酶添加量应控制在0.020%，即当添加量为20 000 U/g原料时，酶解效果最佳。

图1 木瓜蛋白酶添加量对酶解度的影响

2.2 酶解温度对酶解效果的影响

酶解温度是决定酶催化活性重要参数之一，温度过高或过低均会抑制酶活性甚至失活，从而导致酶解效果变差[8]。在料液比1∶10 g/mL、pH 6.5、木瓜蛋白酶添加量0.020%、酶解时间8 h的条件下，酶解温度对酶解效果的影响，如图2所示。当溶液温度低于45℃时，酶解度随温度升高而增加；当溶液温度为45 ℃时，酶解度最大，为69.68%；当高于45 ℃时，酶解度随温度的升高而减少（p＜0.05）。故木瓜蛋白酶酶解带鱼下脚料的最佳温度应是45 ℃。

图2 温度对酶解度的影响

2.3 酶解pH对酶解效果的影响

酶解溶液pH也是决定酶催化活性重要参数之一，pH过高或过低均会抑制酶活性甚至失活，从而导致酶解效果变差[8]。在料液比1∶10 g/mL、酶解温度45 ℃、木瓜蛋白酶添加量0.020%、酶解时间8 h条件下，酶解溶液pH对酶解效果的影响，如图3所示。当pH低于6.5时，酶解度随pH升高而增加；当溶液pH为6.5时，酶解度最大，为70.06%；当pH高于6.5时，酶解度随pH的升高而减少（p＜0.05）。故木瓜蛋白酶水解带鱼下脚料的最佳pH应是6.5。

图3 pH对酶解度的影响

2.4 酶解时间对酶解效果的影响

酶解时间对木瓜蛋白酶酶解的效果，与木瓜蛋白酶添加量对木瓜蛋白酶酶解的效果相似。一般说来，酶解时间越长，酶解得越彻底，但酶解时间过长会产生苦味氨基酸，且造成能源的严重浪费[9]。在料液比1∶10 g/mL、pH 6.5、酶解温度45 ℃、木瓜蛋白酶添加量0.020%条件下，酶解时间对酶解效果的影响，如图4所示。当酶解时间为0～8 h时，酶解度随酶解时间的延长呈不断增加的趋势，最高达到70.07%；继续酶解，酶解度随酶解时间的增加趋势不显著（p＞0.05）。所以，当木瓜蛋白酶水解带鱼下脚料8 h时，酶解完全。

图4 时间对酶解度的影响

2.5 正交试验优化酶解条件

根据前期单因素实验结果，发现水解时间、pH、温度、加酶量等对水解度有不同的影响。现以水解时间、pH、温度、加酶量设计四因素三水平正交试验（表1和表2），以确定木瓜蛋白酶水解带鱼蛋白的最佳水解条件。

以酶解时间、酶解pH、酶解温度、木瓜蛋白酶活力为影响因素，设计四因素三水平正交试验，其试验结果见表2。由表2可知，影响水解度的因素依次为D＞B＞C＞A，即酶活力＞pH＞温度＞时间。通过进一步方差分析，由表3可看出酶活力对水解度的影响最显著，其次是pH、温度和时间，它们对水解度的影响不显著（p＞0.05）。通过正交试验，获得最佳酶解工艺组合，为A1B2C2D2，即时间6 h、pH 6.5、温度45℃、加酶量20 000 U/g带鱼。通过验证试验，带鱼酶解液的水解度可达到71.3%。

表1 因素与水平

表2 L9(34)正交试验结果

表3 方差分析表

3 结论

用木瓜蛋白酶对带鱼下脚料进行酶解，经过单因素试验优化和正交试验验证，在料液比1︰10 g/mL、加酶量20 000 U/g带鱼、45 ℃、pH 6.5、酶解6 h条件下，带鱼蛋白水解度高达71.3%。该研究结果为后续带鱼蛋白水解肽-金属配合物的制备条件做基础研究，为提高带鱼下脚料的高值利用提供条件[10]。