重组大肠杆菌发酵生产树莓酮

王程程，郑璞*，陈鹏程，杨波

1(工业生物技术教育部重点实验室(江南大学)，江苏 无锡，214122) 2(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122)

树莓酮，又称为覆盆子酮[1-2]，是树莓果的主要香气成分，具有特征性甜果香气[3-4]，存在于树莓、黑莓、葡萄和大黄等水果与蔬菜中[5]。覆盆子酮由于其独特的香味特性在食品工业、化妆品工业、医药行业及农业上具有广泛的应用[6-8]。近年来，有研究发现覆盆子酮可以作用于脂肪代谢，具有减肥功效[9-10]。现如今覆盆子酮在香料工业中，已成为仅次于香兰素的一种具有极高经济价值的香料[11]。

水果中覆盆子酮的含量极低，只有1～4 mg/kg[12]，因此从植物中抽提覆盆子酮的成本很高，约为$3 000 /kg[13-14]。目前覆盆子酮的工业生产主要以化学合成法为主，但是根据EC香精指示(88/388/EEC)文件的要求，化学合成的覆盆子酮并不属于天然覆盆子酮，这使得其应用领域受到一定的限制。近年来通过微生物代谢工程合成覆盆子酮的研究逐渐兴起[15]。2007年BEEKWILDER等[5]首次构建合成覆盆子酮的重组大肠

杆菌，但其产量仅为5 mg/L，并伴有柚皮素等其他物质生成。2016年LEE等[16]在酵母菌中构建了覆盆子酮的从头合成途径，产量为2.8 mg/L，同时以对香豆酸为前体生产覆盆子酮的最高产量达到7.5 mg/L。本文以对香豆酸为底物，利用源于植物的4-香豆酰辅酶A连接酶(4-coumarate: CoA ligase，4CL1)[16]、苄基丙酮合酶(benzalacetone synthase，BAS)[17]、苄基丙酮还原酶(raspberry ketone/zingerone synthase，RZS1)[18]3个基因，通过构建重组质粒pCDF-4CL1和pET-BAS-RZS1，导入大肠杆菌中异源表达，以提高大肠杆菌工程菌合成覆盆子酮的能力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒(表1)

表1 本研究中所用质粒及菌株Table 1 Plasmids and strains used in this study

1.1.2 酶与试剂

PrimeSTAR HS DNA Polymerase、T4 DNA Ligase、QuickCutEcoR I、QuickCutHind III、QuickCutSal I、QuickCutKpn I、QuickCutBgl II均购自TaKaRa公司；柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、柱式DNA胶回收试剂盒、IPTG、硫酸链霉素、氨苄青霉素：生工生物工程(上海)股份有限公司；引物的合成以及测序由金唯智生物科技有限公司完成；SDS-PAGE凝胶快速配置试剂盒：碧云天生物技术有限公司；标准品底物对香豆酸(纯度≥98%)、中间产物对羟基亚苄基丙酮(纯度≥97%)、产物覆盆子酮(纯度≥99%)：阿拉丁试剂(上海)有限公司。

1.1.3 培养基

LB培养基(g/L)：含胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，pH为7.0。

TB培养基(g/L)：胰蛋白胨12，酵母提取物24，甘油5，KH2PO42.31，K2HPO412.54，pH为7.0。

固体培养基在此基础上添加1.5%琼脂粉。

相应的抗生素(50 mg/L硫酸链霉素，100 mg/L氨苄青霉素)。

1.1.4 主要仪器与设备

小型高速离心机(Centrifuge 5418)，德国Eppendorf公司；台式高速冷冻离心机(TGL-20M)，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；721可见光分光光度计(JH-12-12)，上海菁华科技仪器有限公司；金属浴(MK-20)，杭州奥盛仪器有限公司；超声破碎仪(92-IIN)，宁波新芝生物科技股份有限公司；酶标仪(EPOCH2T)，美国伯腾仪器有限公司；PCR仪(Biosafer 9700)，赛飞(中国)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 目的片段的获得及扩增

1.2.2 表达载体的构建

将目的基因4CL1的PCR产物和质粒pCDF-DUET-1用快切酶EcoR I与Hind III进行双酶切，纯化并回收；将目的基因BAS的PCR产物和质粒pET-DUET-1用快切酶EcoR I与Sal I进行双酶切，纯化并回收；将酶切的PCR产物和对应的线性质粒使用T4连接酶16 ℃过夜连接。连接产物加入到E.coliJM109的感受态中，42 ℃热击90 s，之后将其放冰中静置2 min，加入1 mL LB培养基，于37 ℃，110 r/min培养1 h之后，离心收集菌体，并将菌体重悬于100 μL的LB培养基中，分别涂布于含有50 mg/L的硫酸链霉素及100 mg/L的氨苄青霉素的LB固体培养基上，37 ℃培养12 h。挑取平板上的单菌落进行菌落PCR验证。将验证正确的重组菌株进行培养，提取重组质粒pCDF-4CL1和pET-BAS，并进行双酶切验证，将菌落PCR与双酶切验证都正确的质粒送去测序。将目的基因RZS1的PCR产物以及质粒pET-BAS按照同样的方法构建重组质粒PET-BAS-RZS1。重组质粒pCDF-4CL1和pET-BAS-RZS1，构建图形如图1所示。

a-质粒pCDF-4CL1;b-质粒pET-BAS;c-质粒pET-BAS-RZS1图1 重组质粒图谱Fig.1 Maps of recombinant plasmids

将菌落PCR、双酶切及测序验证都正确的重组质粒pCDF-4CL1和PET-BAS-RZS1同时导入到E.coliW3110 (DE3)感受态细胞中，涂布于添加50 mg/L硫酸链霉素和100 mg/L氨苄青霉素抗性平板，37 ℃培养12 h，之后挑取单菌落进行菌落PCR验证，获得阳性克隆，得到重组大肠杆菌。

1.2.3 培养方法

摇瓶培养方法：将-80 ℃甘油管保藏的重组菌株接种在添加50 mg/L硫酸链霉素和100 mg/L氨苄青霉素抗性的LB固体平板上分离活化后，挑取单菌落转接至30 mL LB液体培养基中，37 ℃、110 r/min过夜培养。以体积分数5%的接种量将种子液接种于新鲜的40 mL TB培养基(含有50 mg/L硫酸链霉素和100 mg/L氨苄青霉素)中，37 ℃、110 r/min培养到OD600在0.8～1.2范围时，加入诱导剂IPTG以诱导目的基因表达。每隔12 h取1次样，用HPLC检测底物对香豆酸和产物覆盆子酮的含量。所有的摇瓶发酵设置3个平行，取平均值。

分批发酵培养方法：将-80 ℃甘油管保藏的重组菌株接种在添加50 mg/L硫酸链霉素和100 mg/L氨苄青霉素抗性的LB固体平板上划线活化后，挑取单菌落转接至30 mL LB液体培养基中，37 ℃、110 r/min摇瓶过夜培养。以2%(体积分数)接种量将活化后的菌种转接于75 mL LB液体培养基中，37 ℃、110 r/min培养8 h作为种子液，以5%(体积分数)的接种量接种于3 L发酵罐中(装液量为1.5 L；TB培养基)。发酵条件如下：搅拌转速随溶氧变化，溶氧保持在20%～30%，通气量1 vvm，体积分数25%的氨水和25%的硫酸维持发酵液的pH为7.0。每隔2～3 h取1次样，测量OD600、残糖及底物对香豆酸和产物覆盆子酮的含量。

分批补料发酵培养方法：前期种子液的培养方式如分批发酵培养方法，发酵罐上培养方法有所变化，其发酵条件如下：搅拌转速随溶氧变化，溶氧保持在20%～30%，通气量 1 vvm，体积分数25%的氨水和25%的硫酸维持发酵液的pH为7.0。每隔2～3 h取一次样，测量OD600、残糖及底物对香豆酸和产物覆盆子酮的含量，每当葡萄糖消耗完时一次性补加20 g/L左右的葡萄糖。

1.2.4 重组菌株摇瓶发酵条件优化

起始诱导时间优化：将过夜培养的种子液以5%的接种量接种至40 mL新鲜的TB培养基(含有50 mg/L硫酸链霉素和100 mg/L氨苄青霉素)中，37 ℃、110 r/min培养1、1.25、1.5、1.75、2、2.25及2.5 h时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG及终质量浓度为300 mg/L的底物对香豆酸，在20 ℃、110 r/min条件下诱导目的基因表达，培养72 h发酵结束，取样，HPLC检测产物覆盆子酮的产量。

IPTG浓度优化：将过夜培养的种子液以5%(体积分数)的接种量接种至40 mL新鲜的TB培养基(50 mg/L硫酸链霉素和100 mg/L氨苄青霉素)中，37 ℃、110 r/min培养2 h时加入终浓度分别为0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 mmol/L的IPTG及终质量浓度为300 mg/L的底物对香豆酸，在20 ℃、110 r/min条件下诱导目的基因表达，培养72 h发酵结束，取样，HPLC检测产物覆盆子酮的产量。

诱导温度优化：将过夜培养的种子液以5%(体积分数)的接种量接种至40 mL新鲜的TB培养基(50 mg/L硫酸链霉素和100 mg/L氨苄青霉素)中，37 ℃、110 r/min培养2 h时加入0.8 mmol/L的IPTG以及终质量浓度为300 mg/L的底物对香豆酸，分别放到16、20、25、30及37 ℃条件下诱导目的基因表达，培养72 h发酵结束，取样，HPLC检测产物覆盆子酮的产量。

1.2.5 底物及代谢产物的定量检测

采用高效液相色谱(HPLC)检测方法。

紫外检测方法：取1 mL发酵液12 000 r/min离心5 min，之后取500 μL上清液与等体积的甲醇混合，12 000 r/min离心5 min，用0.22 μm的滤膜过滤，HPLC(Waters)定量检测底物对香豆酸和产物覆盆子酮。具体检测条件：色谱柱为AmethystC18-H(4.6 mm×250 mm, 5 μm)反相色谱柱，检测波长222 nm，柱温35 ℃，流动相为V(乙腈)∶V(0.1%磷酸)=2∶8，进样量为20 μL，流速1 mL/min。

示差检测方法：取1 mL发酵液12 000 r/min离心5 min，用0.22 μm的滤膜过滤，HPLC(Waters)定量检测代谢产物乙酸。具体检测条件：色谱柱为Carbomix H-NP 10∶8%(7.8 mm×300 mm, 10 μm)反相色谱柱，柱温55 ℃，流动相为3.3 mmol/L硫酸，流速0.5 mL/min，进样量10 μL，流速0.5 mL/min。

2 结果与讨论

2.1 重组菌株的构建

以合成的4CL1，BAS和RZS1基因为模板，采用引物4CL1F、4CL1R, BASF、BASR, RZS1F、RZS1R进行目的片段的扩增，得到相应的PCR产物，并用核酸电泳表示其大小。目的基因4CL1大小为1 686 bp，BAS为1 155 bp，RZS1为1047 bp，如图2所示。图2-a所示的目的条带大小约为1 600 bp，与4CL1大小吻合，图2-b所示的目的条带大小约为1 100 bp，与BAS大小相吻合，图2-c所示的目的条带大小约为1 000 bp，与RZS1大小吻合。

a-4CL1基因；b-BAS基因；c-RZS1基因图2 PCR扩增结果电泳Fig.2 Electrophoretograms of PCR products

将重组质粒pCDF-4CL1和质粒pET-BAS-RZS1分别导入到E.coliJM109的感受态中，进行菌落PCR验证，挑取阳性克隆，培养，提取质粒，使用EcoR I与Hind III对重组质粒pCDF-4CL1进行双酶切验证，验证结果如图3-a所示，其目标条带在1 000 bp与2 000 bp之间，与已知4CL1大小1 686 bp位置相符合；分别使用EcoR I、Sal I，Bgl II、Kpn I及EcoR I、Kpn I对重组质粒pET-BAS-RZS1进行酶切验证，验证结果如图3-b所示。

a-质粒pCDF-4CL1双酶切验证核酸胶图；b-质粒pET-BAS-RZS1双酶切验证胶图;a-中泳道1中1 500～2 000 bp中间的条带表示4CL1基因；b中泳道1中1 000 bp左右的条带表示RZS1基因，泳道2中1 000～1 500 bp中间的条带表示BAS基因，泳道3中2 000～3 000 bp中间的条带表示RZS1与BAS的基因长度之和图3 重组质粒酶切验证Fig.3 Identification of recombinant plasmids by digestion with restriction endonuclease

由图3-b可知，其1、2泳道的目标条带都在1 000 bp与2 000 bp之间，与已知RZS1、BAS大小位置相符合，3泳道的目的条带在2 000 bp与3 000 bp之间，与BAS和RZS1相加的大小位置相符；将验证正确的重组质粒pCDF-4CL1和pET-BAS-RZS1进行测序验证，并将测序正确的质粒pCDF-4CL1和pET-BAS-RZS1同时转入感受态E.coliW3110 (DE3)中，以获得重组菌株WCC-1。

2.2 重组菌株WCC-1产覆盆子酮培养条件优化

首先确定重组菌株WCC-1开始诱导的最佳时间，接种1 h后开始添加诱导剂IPTG，起始诱导时间范围为1～2.5 h，其中时间间隔为15 min，诱导到72 h后发酵结束，取上清液按照1.2.5所述的方法检测覆盆子酮的含量，发现在培养2 h时添加IPTG，可以获得最大的覆盆子酮产量，为91.55 mg/L，其结果如图4。

图4 起始诱导时间对覆盆子酮产量的影响Fig.4 Effect of culture age on the production of raspberryketone

在最佳起始诱导时间的基础上确定诱导剂IPTG的最适浓度，使IPTG浓度变化从0到1.5 mmol/L设置梯度变化，诱导到72 h后发酵结束，取上清液按照1.2.5所述的方法检测覆盆子酮的含量，如图5。发现随IPTG浓度的增加，覆盆子酮的产量增加。当IPTG浓度为0.8 mmol/L时，覆盆子酮的产量达到最高，为95.59 mg/L，之后再增加诱导剂IPTG的用量对覆盆子酮的产量并无明显的提高作用，且考虑到经济因素最终确定最适IPTG浓度为0.8 mmol/L。

图5 不同IPTG浓度对覆盆子酮产量的影响Fig.5 Effect of IPTG concentration on the production of raspberry ketone

在一定温度范围内，过高的温度会导致蛋白快速表达，折叠出错，易形成包涵体，但过低的温度又会影响菌体的生长，从而影响产物产量，因此诱导温度在蛋白表达过程中起关键性的作用。如图6所示，在最佳起始诱导时间和最适诱导剂IPTG添加量条件下，在16～37 ℃范围内设置了5个温度梯度，当诱导温度为30 ℃时，覆盆子酮的产量最高，达到了125.86 mg/L，而且可以发现，当诱导温度为37 ℃时，覆盆子酮的产量急剧下降，证明诱导温度确实对产物产量有非常大的影响。

图6 不同诱导温度对覆盆子酮产量的影响Fig.5 Effect of induction temperature on the production of raspberry ketone

2.3 重组菌株3 L发酵罐发酵生产覆盆子酮

2.3.1 重组菌株WCC-1分批发酵

按照1.2.3中所示的分批发酵培养方法，接种后37 ℃培养至OD600为6～8时，将发酵温度降到30 ℃，加入500 mg/L的底物对香豆酸以及0.8 mmol/L IPTG诱导目的基因表达，发酵结果如图7所示。

图7 重组菌株WCC-1分批发酵Fig.7 Batch fermentation of recombinant strain WCC-1

加入诱导剂后覆盆子酮开始积累，接种7 h后葡萄糖耗尽，同时细胞开始以已经积累的乙酸作为碳源，发酵20 h之后葡萄糖和乙酸全部消耗完，OD600基本保持在22左右，在45 h时覆盆子酮的产量达到最大，为78.38 mg/L。LIM等[17]研究重组大肠杆菌合成白藜芦醇时，发现通过添加浅蓝菌素抑制脂肪的合成，增加胞内丙二酰CoA的含量，从而使得白藜芦醇的产量提高了2倍，说明了前体物质丙二酰CoA的重要性。丙二酰CoA也是重组大肠杆菌合成覆盆子酮的前体之一，分批发酵产量低于摇瓶产量的原因，一方面可能是由于乙酸的产生消耗了部分乙酰CoA，使得合成覆盆子酮的前体物质丙二酰CoA的供给不足；另一方面，也有可能是发酵罐中菌体生长优于摇瓶发酵，葡萄糖供给相对不足，造成覆盆子酮的产量较低。

2.3.2 重组菌株WCC-1补料分批发酵

种子液制备及罐上培养方法同2.3.1中所述的分批发酵培养方法，补料分批发酵结果如图8所示，接种后6 h时葡萄糖耗尽，开始进行一次性补料(20 g/L葡萄糖)，此时每当葡萄糖耗尽就进行补料，一共补料6次，菌体量在51 h时达到最大，之后开始缓慢下降，说明细胞生长进入衰亡期。在这一阶段，葡萄糖和乙酸都已耗尽，覆盆子酮产量增速也趋于平缓，在68 h时，产物覆盆子酮的产量达到峰值，为178.13 mg/L，较分批发酵提高2.27倍。

图8 重组菌株WCC-1补料分批发酵Fig.8 Fed batch fermentation of recombinant strain WCC-1

3 结论

通过在大肠杆菌W3110(DE3)中引入来源于植物的4-香豆酰辅酶A连接酶(4CL1)、苄基丙酮合酶(BAS)和苄基丙酮还原酶(RZS1)基因，成功构建了重组菌株WCC-1。通过对起始诱导时间、诱导剂IPTG浓度、诱导温度的优化，该菌株摇瓶发酵产覆盆子酮质量浓度可达125.86 mg/L。在3 L发酵罐上进行补料分批发酵，覆盆子酮质量浓度提高到178.13 mg/L，较目前已报道的微生物产覆盆子酮的最高产量(7.5 mg/L)显著提高，并展现了微生物发酵生产树莓酮的应用前景。