枸骨茎叶甲醇粗提物及其抑菌活性初步研究

张金蒙，许秋涧，陈洋，蔡敏，文念念，张少虎，曾志刚

(湖北科技学院核技术与化学生物学院，湖北 咸宁 437100)(湖北科技学院核技术与化学生物学院，湖北 咸宁 437100 湖北省香花植物工程技术研究中心，湖北 咸宁 437100)

天然产物是新农药创制的重要资源，从天然产物中筛选先导化合物及以天然产物为探针发现新靶标是天然产物研究的重点领域，是利用天然产物创制新农药的主要途径[1]。枸骨(Ilexcornuta)为冬青科冬青属药用植物，资源丰富，主要分布于我国长江中下游地区。枸骨提取物化学成分丰富，药理活性多样，具有较高的研究价值。

枸骨的根、枝、叶和果都可用于制药[2,3]。枸骨叶具有多种药理活性，如清热养阴、平肝益肾等[3]，亦可作为避孕和心血管疾病药物以及抗菌剂[4]。枸骨根有祛风止痛的功效，用于风湿关节痛、腰肌劳损、头痛、牙痛以及黄疸型肝炎等病症，是一种具有重要药用价值的中药材[5]。近年来研究表明，枸骨茎叶主要成分为三萜及三萜皂苷、黄酮及其苷类、木质素类及脂肪酸类化合物[3～7]。这些化合物具有治疗喉咙痛、减肥、缓解高血压、抗氧化、抗糖尿病及抑制细菌等作用[4,8～12]。

枸骨提取物的农药活性研究相对较少且主要集中在其内生菌方面。陈列忠等[13]、石一珺等[14]和申屠旭萍等[15]报道了枸骨内生真菌哈茨木霉(Trichodermaharzianum)及其产生的抗真菌活性的次级代谢产物Trichodermin。抑菌试验结果表明，哈茨木霉菌对黄瓜立枯病菌存在竞争和寄生作用，Trichodermin对蕃茄早疫病、黄瓜立枯病以及番茄灰霉病有较好的预防作用和治疗作用。刘敏[16]、郭也等[17]报道了从枸骨叶中分离的内生真菌IFB-GLP-4，该真菌具有抗芽孢杆菌活性且能产生新骨架化合物。赵龙飞等[18]研究了从枸骨健康植株的根、茎、叶及果实中分离得到的85种内生细菌的活性，结果表明部分菌株对烟草赤星病菌、稻瘟病菌、棉花枯萎病菌等植物病害具有较好的抑制作用。目前关于枸骨提取物医药活性的研究比较突出，而农药活性方面的报道则较为少见。为初步明确枸骨的农药活性，本研究探讨了枸骨茎叶甲醇粗提物对部分植物真菌病害的抑制作用，以期为枸骨的合理利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

枸骨茎叶采摘于湖北科技学院温泉校区附近，置于鼓风干燥箱在40℃下烘干，微型粉碎机粉碎过60目筛，得枸骨茎叶粉末。

供试菌种有水稻稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、芒果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、苹果轮纹病菌(Botryosphaeriadothidea)、香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)，均来源于湖北科技学院核技术与化学生物学院微生物实验室。

PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，无菌水1000mL。

1.2 仪器设备

主要仪器设备有MP2002电子分析天平(上海恒平科学仪器有限公司)、SPX-280生化培养箱(宁波江南仪器厂)、WD900G微波炉(格兰仕微波炉电器有限公司)、DHG90A电热鼓风干燥箱(上海索普仪器有限公司)、SW-CJ-2FD双人超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)等。

1.3 试验方法1.3.1 粗提物的制备

首先，将粉碎后的约1.5kg枸骨茎叶粉末倒入2.5L棕色试剂瓶中，用甲醇浸泡7d，期间每隔1～2d进行振荡摇匀。然后，将该甲醇浸提液过滤，滤液经减压浓缩、真空干燥后，得到约30g黑色膏状物。所得膏状物密封后置于冰箱保鲜层(4℃)用于后续实验。

1.3.2 粗提物抑菌活性测定

采用菌丝生长速率法[19]测定粗提物对供试菌种的抑制作用。首先，将粗提物用70%乙醇溶解，无菌水溶液稀释至100mg/mL。然后，吸取2mL上述药液，与18mL冷却至50℃的PDA培养基充分混匀，倒入平板，即得含10mg/mL粗提物的培养基。空白对照为添加相同量的无菌水。

用打孔器(d=0.5cm)取靶标病菌，将所得菌饼移至前述含药平板中央，28℃恒温培养，同一处理重复3次。当对照平板上菌落布满至培养皿2/3左右时，采用十字交叉法测量并记录菌落直径。菌丝生长抑制率计算公式如下：

式中：DCK为空白对照菌落直径;Dt为处理组菌落直径。

2 结果与分析

2.1 枸骨茎叶粗提物的抑菌活性

生物活性测试结果表明，10mg/mL的枸骨茎叶粗提物对水稻稻瘟病、小麦赤霉病、苹果轮纹病、芒果炭疽病以及香蕉枯萎病等植物真菌病害表现出一定的抑制作用(见表1和图1)。其中，粗提物在该浓度下对水稻稻瘟病和小麦赤霉病的抑制活性较好，抑制率分别为100.00%，89.86%。这说明粗提物在防治相关植物真菌病害方面具有潜在的利用价值。

表1 10mg/mL的枸骨茎叶粗提物对供试菌种的抑制作用

注：a1～a5分别为菌株A～E处理菌落；b1～b5分别为相应对照。图1 粗提物对5种病原真菌的抑制效果

2.2 枸骨茎叶粗提物对病菌的毒力效果

鉴于粗提物对水稻稻瘟病和小麦赤霉病表现出良好的抑制作用，进一步研究了粗提物在浓度分别为2、4、6、8mg/mL下对上述2种病原菌菌丝生长的影响(表2、图2及图3)，以明确其毒力效果。从表2可以看出，枸骨茎叶甲醇提取物在测试浓度下对水稻稻瘟病菌和小麦赤霉病菌均具有一定的抑制活性，不同浓度之间抑制活性差异较为显著且随提取物浓度的增大而增强。

粗提物对靶标菌的半数效应浓度(EC50)及其毒力回归方程通过SPSS 22.0软件计算求得。其中，粗提物对水稻稻瘟病菌的毒力回归方程为y=0.1058x-0.0615，相关系数R2为0.9842，EC50为4.616mg/mL。对小麦赤霉病菌的毒力回归方程为y=0.063x+0.2507，相关系数R2为0.9664，EC50为3.425mg/mL。毒力回归方程的相关系数均大于0.9，表明粗提物的浓度和抑菌效果呈正相关，即粗提物的浓度越高，抑菌效果越好。由此可以看出，枸骨茎叶甲醇提取物对小麦赤霉病菌和水稻稻瘟病菌防效较好，对挖掘天然源绿色杀菌分子具有一定的参考意义。

表2 不同浓度枸骨茎叶粗提物对水稻稻瘟病菌和小麦赤霉病菌的抑制作用

注：a、b、c、d、e、f分别代表0、2、4、6、8、10mg/mL粗提物图2 不同浓度粗提物对水稻稻瘟病菌的活性

注：a、b、c、d、e、f分别代表0、2、4、6、8、10mg/mL粗提物图3 不同浓度下粗提物对小麦赤霉病菌的活性

3 结语

植物性农药生物活性多样，作用方式复杂，具高效、低毒、对环境友好等优点[20]。从植物中寻找具有农药活性的物质，发掘先导化合物，开发绿色农药，是新农药创制的重要途径。枸骨是一种具有较高药用价值的植物，是天然产物研究中的热点。目前关于枸骨化学成分及其医药用途的研究较多，而鲜见有关于其农药活性方面的报道。本研究结果表明，枸骨茎叶提取物对水稻稻瘟病菌和小麦赤霉病菌表现出较好的抑菌活性。这说明在该提取物中存在一类或几类可抑制相关农业真菌病害的物质，提示其可能在农用杀菌剂方面具有一定的开发潜力。因此，厘清枸骨提取物中具体的农药活性成分和及其作用机理，将有助于绿色防控植物真菌病害和发掘生态环境友好型农药分子。