响应面法优化提取香菜根中总黄酮的工艺研究

张珍，杨秦,2，肖洪,3,4，史晶晶，金玉成，刘士健*

(1.西南大学 食品科学学院，食品科学与工程国家级实验教学示范中心(西南大学)，重庆 400715； 2.西南大学 柑桔研究所，重庆 400712；3.北京正博和源科技有限公司，北京 102400； 4.北京正博和源科技有限公司重庆分公司，重庆 400716)

香菜的别称是芫荽，是伞形科植物的一种，作为一种芳香蔬菜，香菜是历史上最早被食用的，因为它具有特殊的香味，也常常被用作调味料，香菜最早被发现是在地中海沿岸及中亚地区，西汉时期被传入中国，同时对中国古代的饮食产生了很大的影响[1-4]。香菜的茎叶中具有丰富的营养素，如蛋白质、脂肪、矿物质、纤维素、钾、钙、钠、铁、维生素等。对香菜根部进行检测，发现其根部也具有多种化学成分，这些化学成分有糠醛、不饱和脂肪酸酯、萜类、黄酮等[5]，同时香菜根可以作为提取天然糠醛的原料[6]。

总黄酮按结构可分为黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类、二氢黄酮类等[7]。众多实验结果表明总黄酮具有很强的抗氧化性、抗病毒能力[8]，能够抑制炎症、多种疾病甚至癌症[9]，有的黄酮还具有抗心血管疾病的作用[10]。黄酮的提取方法有热水提取法、超声提取法、碱液提取法、超滤法、微波提取法等[11]，其中超声提取法和微波提取法有提取时间短、提取量多、提取条件温和对总黄酮的活性影响较小等优点[12,13]。黄酮含量的测定方法有分光光度法、高效液相色谱法、薄层扫描法、毛细管电泳法等[14]，毛细管电泳法前期处理样品简单，溶剂消耗少，结果准确，是值得推荐的测量方法[15]。人们习惯使用香菜茎叶，往往会将香菜根丢弃，香菜的根部含有一定量的黄酮，然而对香菜根中的提取工艺黄酮研究较少，因此本研究探索了响应面法优化提取香菜根中总黄酮的工艺，为香菜的研究提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

香菜根 山东省泰安市；芦丁(Rutin)标准品 安徽合肥博美；无水乙醇、亚硝酸钠、氢氧化钠等试剂(均为分析纯)；722型可见光分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 常州澳华仪器有限公司；1580多功能离心机 基因有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的测定

精确称取0.0191 g干燥的芦丁标准品放于烧杯中，用70%的乙醇溶解，用玻璃棒引流至100 mL的容量瓶中，玻璃棒和烧杯需用70%的乙醇多次润洗，用70%乙醇定容，摇匀，得质量浓度为0.0191 g/mL的标准溶液。先用移液管分别吸取1，2，3，4，5，6 mL标准品溶液，置于6个25 mL容量瓶中，空白容量瓶中用移液管移取6 mL 70%乙醇溶液，再加入1 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，6 min后加入1 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，6 min后加入10 mL 4%氢氧化钠溶液，摇匀，用体积分数70%的乙醇定容至25 mL，充分摇匀，静止15 min后，于510 nm波长处测定吸光度,并绘制标准曲线[16]。标准曲线方程为y=0.4572x+0.0017；相关系数R2=0.9998。标准曲线图见图1。

1.2.2 总黄酮含量的计算

由标准曲线得到样品溶液的浓度，再根据浓度计算总黄酮的含量：

总黄酮提取量(mg/g)=C×V×n/W。

式中：C为标准曲线上获得的浓度，g/mL；V为黄酮提取液的体积，mL；n为稀释倍数；W为香菜根粉末的重量，g。

图1 芦丁溶液标准曲线图Fig.1 Standard curve of rutin solution

1.2.3 单因素试验

将购买的香菜根洗净，切成小段，放置于电热恒温干燥箱内，70 ℃干燥6 h至恒重。干燥好的香菜根用粉碎机打磨成粉，过40目筛，将过筛后的粉末装于自封袋中，并保存在干燥器内待用。

准确称取香菜根粉末1.0 g，置于具塞三角瓶中，分别以提取时间、提取温度、液料比、乙醇体积分数为单因素，研究不同单因素对香菜根总黄酮提取量的影响[17]。

1.2.3.1 确定最佳提取时间

准确称取香菜根粉末1.0 g，固定乙醇体积分数70%、液料比20∶1(mL/g)、提取温度70 ℃的条件不变，设置提取时间为3，3.5，4，4.5，5 h进行提取。

1.2.3.2 确定最佳提取温度

准确称取香菜根粉末1.0 g，固定乙醇体积分数70%、液料比20∶1(mL/g)、提取时间4.5 h的条件不变，设置提取温度为60，65，70，75，80 ℃进行提取。

1.2.3.3 确定最佳液料比

准确称取香菜根粉末1.0 g，固定乙醇体积分数70%、提取时间4.5 h、提取温度70 ℃的条件不变，设置液料比为20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1(mL/g)进行提取。

1.2.3.4 确定最佳乙醇体积分数

准确称取香菜根粉末1.0 g，固定提取时间4.5 h、提取温度70 ℃，液料比30∶1(mL/g)的条件不变，设置乙醇体积分数为60%、65%、70%、75%、80%进行提取。

1.2.4 响应面试验设计

用Design-Expert V8.0.6 软件处理数据，依据单因素试验结果，利用Box-Behnken 中心组合试验设计原理[18]，选取液料比(A)、乙醇体积分数(B)、提取温度(C)为试验因素，将总黄酮提取量作为响应值，设计试验，响应面因素水平见表1。

表1 响应面分析因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取时间对香菜根总黄酮提取量的影响

准确称取香菜根粉末1.0 g，固定乙醇体积分数70%、液料比20∶1(mL/g)、提取温度70 ℃的条件不变，设置提取时间3，3.5，4，4.5，5 h进行提取，试验结果见图2。

由图2可知，在3～4.5 h之间，香菜根总黄酮的提取量与时间呈正相关；当提取时间达到4.5 h，后总黄酮的提取量呈下降趋势，这可能是总黄酮随着时间的增加已经基本被提取出来，4.5 h后随着时间的增加被提取出的总黄酮会被分解一小部分，从而导致曲线呈下降趋势。

图2 提取时间对总黄酮提取量的影响Fig.2 The effect of extraction time on extraction amount of total flavonoids

2.1.2 提取温度对香菜根总黄酮提取量的影响

准确称取香菜根粉末1.0 g，固定乙醇体积分数70%、液料比20∶1(mL/g)、提取时间4.5 h的条件不变，设置提取温度为60，65，70，75，80 ℃进行提取，试验结果见图3。

图3 提取温度对总黄酮提取量的影响Fig.3 The effect of extraction temperature on extraction amount of total flavonoids

由图3可知，香菜根总黄酮的提取量在70 ℃时达到最大。当温度低于70 ℃时，有可能由于乙醇分子与香菜根颗粒接触不够充分，导致总黄酮的提取量较少；当温度大于70 ℃时，因为温度的提高而导致乙醇挥发，使得实际的乙醇体积分数低于70%，也有可能是因为香菜根中部分黄酮物质受热易分解，所以没有70 ℃下提取量大，最终得出70 ℃是最优的提取温度。

2.1.3 液料比对香菜根总黄酮提取量的影响

准确称取香菜根粉末1.0 g，固定乙醇体积分数70%、提取时间4.5 h、提取温度70 ℃的条件不变，设置液料比为20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1(mL/g)进行提取，试验结果见图4。

图4 液料比对总黄酮提取量的影响Fig.4 The effect of liquid-solid ratio on extraction amount of total flavonoids

由图4可知，从整体上看，液料比在20∶1～30∶1之间，总黄酮的提取量随着液料比的增加而逐渐增加；当液料比在30∶1～40∶1之间，总黄酮的提取量随着液料比的增加而减少，因此可以得到30∶1是香菜根提取总黄酮的最优液料比。

2.1.4 乙醇体积分数对香菜根总黄酮提取量的影响

准确称取香菜根粉末1.0 g，固定提取时间4.5 h、提取温度70 ℃，液料比30∶1(mL/g)的条件不变，设置乙醇体积分数60%、65%、70%、75%、80%进行提取，试验结果见图5。

图5 乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响Fig.5 The effect of ethanol volume fraction on extraction amount of total flavonoids

由图5可知，在乙醇体积分数为60%时，香菜根的总黄酮提取量较少。当乙醇体积分数在65%～70%之间时，乙醇体积分数与香菜根的总黄酮提取量呈正相关；当乙醇体积分数为70%时，香菜根的总黄酮提取量最大，继续增加乙醇体积分数，香菜根的总黄酮提取量有所降低；当乙醇体积分数高达80%时，香菜根的总黄酮提取量最低，这可能是因为相似相溶的原理，极性越接近，溶解度越大，在乙醇体积分数为70%时，溶剂的极性和黄酮的极性最为接近，因此70%为最优的乙醇体积分数。

2.2 响应面优化提取工艺结果

2.2.1 响应面试验设计和试验结果

利用Box-Behnken 组合设计原理，采用Design-Expert V8.0.6软件，根据单因素试验结果选取液料比(A)、乙醇体积分数(B)、提取时间(C)作为自变量，将香菜根中所提取的总黄酮量作为响应值。试验设计的方案和数据处理的结果见表2。

表2 响应面试验设计和试验结果Table 2 Design and results of response surface experiment

续 表

2.2.2 响应面分析

对试验方案设计和试验结果用Desgin-ExpertV8.0.6软件进行统计分析，可得到二次回归方程模型：

Y=+0.17+1.367×10-3A+5.468×10-3B+6.288×10-3C+5.468×10-4AB-1.093×10-3AC-1.641×10-3BC-4.703×10-3A2-0.021B2-0.022C2。

表3 回归线性分析Table 3 The linear regression analysis

注：“*”为显著(P<0.05)；“**”为极显著(P<0.01)。

由表3可知：此模型显著。通过模型的回归方差分析可以得到，一次项A、B、C对总黄酮提取量的影响不显著，二次项B2和C2对试验结果影响极显著(P<0.01)，A2对试验结果影响不显著，AB、AC、BC的交互效应不显著。由F值和P值可知，液料比、乙醇体积分数和提取时间会影响香菜根中总黄酮的提取量，其影响力大小为：液料比<乙醇体积分数<提取时间。液料比、乙醇体积分数、提取时间对香菜根总黄酮提取量影响的响应曲面图见图6～图8。

图6 液料比与乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响Fig.6 Effect of liquid-solid ratio and volume concentration of ethanol on extraction amount of total flavonoids

图7 液料比与提取温度对总黄酮提取量的影响Fig.7 Effect of liquid-solid ratio and extraction temperature on extraction amount of total flavonoids

图8 乙醇体积分数与提取温度对总黄酮提取量的影响Fig.8 Effect of ethanol volume fraction and extraction temperature on extraction amount of total flavonoids

通过Design-Expert V8.0.6软件，输入试验结果可得到图6～图8的响应曲面图，非常直观地表现了两两因素间的交互作用。响应曲面图中图形坡度越小代表相互作用越小，反之则越大。由图6～图8可知，两两因素间均有一定的交互作用，但交互作用相对较弱，其中BC的交互作用比较明显，但并没有达到显著。

2.2.3 最佳工艺条件

通过响应面分析得到乙醇提取香菜根中总黄酮的最佳工艺条件：液料比为30.68∶1 (mL/g)，最佳乙醇体积分数为70.65%，最佳提取温度为70.67 ℃，在的条件下，香菜根中理想的总黄酮提取量为0.1717 mg/g，由于实验室的可操作性，最终将液料比设为31∶1 (mL/g)，乙醇体积分数设为71%，提取温度设为71 ℃。在此条件下再次试验，得到总黄酮的提取量为0.1691 mg/g，说明该模型的预测值与实际值之间有较好的重合性，可以用此方法预测香菜根中总黄酮的提取量。

3 结论

在单因素试验的基础上，使用Design-ExpertV8.0.6软件采用三因素三水平的响应面分析方法，对香菜根中总黄酮的提取工艺进行优化。通过试验验证，可得到最佳的工艺条件为液料比31∶1 (mL/g)，乙醇体积分数71%，提取温度71 ℃，在此条件下，总黄酮的提取量约为0.1691 mg/g，该实验方法有一定的可靠性。