β片层阻断肽H102对AD小鼠识别记忆能力和脑内AMPK-mTOR自噬相关通路的影响*

单尚然， 蒋 方， 徐淑梅

(天津医科大学生理学教研室， 天津 300070)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种与年龄相关、进行性发展的中枢神经系统退行性疾病[1]。该病起病隐匿，由多因素引起，学习记忆力减退、认知功能障碍，最终导致生活自理能力完全丧失，是痴呆最常见的临床表现形式[2]。AD的主要病理学改变是β-淀粉样蛋白在神经元细胞外异常沉积形成的老年斑(senile plaques, SP)和细胞内自我聚集的tau蛋白的过磷酸化所形成的神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)。随着病程的发展，大脑被这些老年斑和神经纤维缠结影响，造成学习和记忆力的的衰退[3]。关于阿尔茨海默症的致病机理，目前仍有争论，有多个学说的提出。目前β 样淀粉样蛋白(amyloid beta-protein，Aβ) 级联学说得到广大学者的广泛认可，作为老年斑主要成分的Aβ 可能是AD 的原发性病理因子，是影响AD发病的核心因素[4]。本课题组的β片层阻断肽H102是专门针对Aβ设计的治疗老年痴呆的新型候选药物，分子组成为十肽水溶性药物，它能够有效抑制 Aβ 的折叠和聚集，减少 Aβ 的含量，制约Aβ对神经元造成损伤，从而影响下游病理过程[5]。本课题组前期已经证实 β 片层阻断肽 H102影响Aβ的生成，包括H102 能够与 β 淀粉样肽相结合，抑制 Aβ 的折叠和聚集； H102 参与 APP 的代谢，影响Aβ 的生成等。但是对H102是否影响Aβ清除的自噬相关通路未有涉及，因此设计本实验观察H102对激活自噬通路的作用。

在真核细胞中，自噬是一种正常的调节性回收衰老细胞组分、清除结构或功能异常细胞器或蛋白聚合物的细胞生理过程。在生理情况下，细胞维持一种较低水平的自噬[6]。当体内积累过多异常折叠的蛋白质时，就会激活相关自噬通路来加速对异常蛋白的清除。自噬作为细胞内清除异常折叠蛋白质、受损细胞器和其他有害物质的主要途径，对β 淀粉样肽产生和清除的平衡具有重要作用[7]。近年来，大量研究表明腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)不仅在维持细胞能量平衡上发挥重要作用，还可以通过细胞内多条通路影响细胞的自噬过程，其中最主要的通路就是胞浆内的AMPK-mTOR 信号通路，这一通路得到广泛研究[8]。本研究旨在观察H102 对AMPK-mTOR自噬通路相关蛋白的影响，以探讨H102 是否可以通过激活自噬途径减少Aβ，对AD起到一定的治疗的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

6月龄APP/PS1双转基因AD雄性小鼠30只，同月龄同背景的C57BL/6J雄性小鼠15只，体重(30.0±1.6)g，购自北京华阜康生物科技有限公司，饲养于天津医科大学动物科学部SPF级实验动物中心。β片层阻断肽H102由上海吉尔生化有限公司采用固相合成法合成。 JLbehv-1新物体识别系统购自北京伯豪生物技术有限公司；免疫组化中DAB试剂盒、即用型SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物公司，生物素二抗试剂盒购自北京鼎国生物公司；Western blot中β-actin抗体购自北京中杉金桥生物公司，P-AMPK抗体购自CST公司，P-mTOR抗体、LC3Ⅱ/Ⅰ抗体购自abcam公司。

1.2 动物分组及给药方法

将30只6月龄的APP/PS1双转基因雄性AD小鼠随机分为AD组和H102干预组(n=15)。将同月龄同背景饲养下的15只C57BL/6J雄性小鼠设为对照组。H102干预组的小鼠每天同一时间段经鼻腔给予H102溶液5 μl(5.8 mg/kg)，对照组和AD组小鼠每日给予等量的的空白辅料溶液 (0.5%壳聚糖、0.1%BSA)。持续给药30 d 。

1.3 新物体识别实验

连续给药30 d后，进行新物体识别实验。实验共分3 d完成，分别为适应、熟悉、测试三阶段。第1日将各小鼠放入敞箱中自由活动10 min。第2日在敞箱中放入相同、位置对称的两个物体，让其自由活动5 min进行探索和学习。第3日将其中一个物体换成颜色和形状均不同的物体，步骤如第2日继续进行探索和学习。系统自动记录每一只小鼠对两个物体的识别时间，并对生成的数据进行实验分析。熟悉阶段主要是排除位置对实验结果的影响，位置偏爱指数用LI表示，测试阶段是测试小鼠在对熟悉物体记忆的基础之上对新物体的探索时间，新物体识别指数用RI表示。

1.4 脑组织样本的制备

新物体识别实验结束后，用25%的乌拉坦4 ml/kg腹腔注射麻醉，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)灌注至肝肺透明，然后处死在冰上取脑，一半脑组织放入4%多聚甲醛溶液中固定，一半脑组织分离皮层和海马放入液氮中后移入-80℃冰箱中保存备用。

1.5 免疫组织化学染色

甲醛固定过的脑组织经修片、脱水、透明、浸蜡、切片进行以下免疫组化实验。脱蜡复水后去离子水浸泡，3%H2O2室温孵育，枸橼酸抗原修复液进行抗原修复。5%BSA封闭后，滴加稀释一定的比例的一抗(P-AMPK 1∶400、P-mTOR 1∶100、LC3Ⅱ/Ⅰ 1∶300)后，4℃过夜，滴加生物素标记的二抗工作液37℃避光孵育30 min，辣根酶标记物(SABC)工作液37℃避光孵育30 min，DAB显色剂显色，镜下控制时间，苏木素复染，梯度酒精脱水，中性树胶封片。阴性对照组用PBS代替一抗进行染色，其余步骤同上。在倒置成像系统下观察并拍摄相同层次的海马和皮层，用image-proplus 6.0软件对染色结果进行光密度(optical density, OD)分析。

1.6 Western blot实验

于-80℃冰箱中取出海马和皮质组织，提取总蛋白，BCA 法定量测定蛋白浓度后调定各组蛋白为等浓度，加适量上样缓冲液，煮沸变性5 min。5% ～ 12%分离胶5%浓缩胶电泳蛋白分离后进行转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入稀释的一抗(P-AMPK 1∶1 000、P-mTOR 1∶10 000、LC3Ⅱ/Ⅰ 1∶3 000)，4℃过夜，加入稀释的二抗(1∶10 000)，室温下孵育2 h，然后ECL发光显色，蛋白条带曝光。用emageJ软件分析所得条带的灰度值。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 新物体识别记忆能力测试结果

实验中各组小鼠熟悉阶段中的位置偏爱指数以及测试阶段中的新物体识别指数如表1所示，实验结果说明各组小鼠的位置偏爱指数均在50%左右，说明我们可以排除位置这个因素对测试阶段实验结果的影响；从实验数据中我们能够看出，与对照组相比，AD 组新物体识别指数显著降低(P<0.05)，与AD 组相比，H102 干预组新物体识别指数显著提高(P<0.05，表1)。

Group LIRIControl51.27±6.8669.68±8.91AD52.34±7.2452.24±7.98 *H10251.58±8.2962.23±8.21#

LI: Location preference index; RI: Recognition index; AD: APP /PS1 double transgenic

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsAD

2.2 免疫组化DAB染色法测定AMPK-mTOR通路相关蛋白的表达

对P-AMPK、LC3Ⅱ蛋白免疫组化染色结果显示，与对照组相比，AD组小鼠脑内P-AMPK、LC3Ⅱ蛋白OD值显著降低(P<0.05),与AD组相比，H102干预组小鼠脑内P-AMPK、LC3Ⅱ蛋白光密度显著提高(P<0.05)。对P-mTOR蛋白，与对照组相比，AD组小鼠脑内P-mTOR蛋白光密度显著提高(P<0.05)，与AD组相比，H102干预组小鼠脑内P-mTOR蛋白光密度显著降低(P<0.05,表2，图1，图1.1，图1.2见彩图页Ⅰ，图1.3见彩图页Ⅴ)。

2.3 Western blot 测定AMPK-mTOR通路相关蛋白的表达

Western blot结果显示，与对照组比较，AD组小鼠蛋白条带明显变细，颜色变浅，P-AMPK、LC3Ⅱ/Ⅰ比值显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与AD组相比，H102干预组小鼠脑内P-AMPK、LC3Ⅱ/Ⅰ比值显著增加，蛋白条带明显变粗，颜色变深，差异有统计学意义(P< 0.05); 对P-mTOR蛋白，与对照组比较，AD组小鼠蛋白条带明显增粗，颜色加深， P-mTOR蛋白蛋白的表达量显著增多，差异有统计学意义(P<0.05)；与AD组相比，H102干预组小鼠脑内P-mTOR表达明显降低，蛋白条带明显变细，颜色变浅，差异有统计学意义(P<0.05,图2.1、2.2，图3)。

Fig.2.1Expressions of P-AMPK, P-mTOR, LC3Ⅱ/Ⅰ ratio level in mice hippocampus

A: Control; B: AD; C: H102; AD: APP /PS1 double Transgenic

Fig.2.2Expressions of P-AMPK, P-mTOR, LC3Ⅱ/Ⅰ ratio level in mice cortex

A: Control; B: AD; C: H102; AD: APP /PS1 double Transgenic

GroupP-AMPKHippocampusCortexP-mTORHippocampusCortexLC3HippocampusCortexControl73.05±9.1589.12±10.6569.96±7.3686.75±11.1679.03±7.5663.09±12.43AD57.93±10.75*74.91±12.72*90.33±8.36*96.87±10.07*56.52±10.16*43.22±7.01*H10285.36±7.55#83.08±8.43#48.62±3.32#67.74±11.40#94.21±8.00#82.09±9.95#

AD: APP /PS1 double transgenic

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsAD

AD: APP /PS1 double transgenic

*P<0.05,**P<0.01

3 讨论

大脑皮层、海马的神经元缺失是阿尔茨海默病(AD)的主要病理结果[9]，所以我们本课题的取材是小鼠大脑的皮层和海马。AD的主要临床特征是学习记忆力减退、认知功能障碍。新物体识别记忆能力测试结果表明，H102干预组的新物体识别指数要明显高于AD组，提示H102对于AD 的预防和治疗具有一定的积极作用。

大量研究表明，Aβ在细胞外的异常聚集形成SP[10]，是AD的重要物质，故清除异常聚集的Aβ至关重要，这个过程主要就是自噬[11]，H102 在小鼠脑区通过自噬来清除Aβ是本课题想要探讨的另一内容。自噬过程包括自噬泡的形成、自噬体的形成、自噬体与溶酶体融合三个阶段[12]。腺苷酸活化蛋白激酶( AMP-activatedprotein kinase，AMPK)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、微管相关蛋白轻链3(LC3)是自噬过程中关键的蛋白质分子。在自噬通路中AMPK-mTOR通路，已经得到广泛的研究[8]。AMPK是三聚体复合体，由催化亚单位α 和调节亚单位β 和γ 组成。在脑组织中α亚型较为丰富[13]。AMPK是能量感受器，主要协调代谢和能量的需要，大量研究表明AMPK作为哺乳动物细胞代谢传感器参与神经变型性变的调控[14]。免疫组化和Western blot 实验结果均表明， H102能够显著活化AMPK，这可能是因为神经元AMPK信号激活主要靠胞浆AMP和Ca2+水平的增高，而H102多肽本质是十种氨基酸组成，可以作为AMPK的激动剂，来通过活化AMPK诱导自噬，清除异常聚集的Aβ。作为自噬调控的中心分子， mTOR能够调节细胞周期及细胞自噬等多种细胞进程。可表现出＂活性开关＂样的作用，激活或抑制自噬通路，保持生理环境的动态平衡。Park 等[15]证明，西洛他唑能激活AMPK，降低mTOR的磷酸化水平，从而抑制mTOR 活性，促进自噬体形成，减少Aβ 的积累，发挥中枢神经保护作用。本实验结果显示，AD小鼠脑内m-TOR过度磷酸化，自噬出现障碍，而H102干预组，P-mTOR显著降低，表明H102可能通过激活AMPK抑制mTOR 活性来诱导自噬，加速Aβ的清除。LC3 是自噬标志物，当自噬泡成熟时，LC3-I 转变为LC3-II( 即自噬体膜型) ，LC3-II /I 比值的大小被广泛用于评估自噬激活的程度[16]。本实验中，AD组LC3Ⅱ/Ⅰ的比值很小，提示AD小鼠脑内出现自噬障碍，H102可显著提高AD小鼠脑内LC3Ⅱ/Ⅰ的比值，表明H102干预组能够重新激活自噬通路加速对Aβ的清除作用。

由此可知，在AMPK-mTOR通路中，H102作为多肽分子，可以通过激活AMPK，抑制mTOR来诱导自噬，加速对Aβ的清除作用，改善AD小鼠的学习记忆能力，达到对AD小鼠治疗的目的。