贮存环境对普洱生茶主要化学成分变化的影响

宁井铭，许姗姗，侯智炜，胡 欣，张正竹

（安徽农业大学 茶树生物学与资源利用国家重点实验室，安徽 合肥 230036）

普洱茶是以地理标志保护范围内的云南大叶种（Camellia sinensis var. assamica（Mast.）Kitamura）晒青毛茶为原料，按特定的加工工艺生产成具有独特品质特征的茶叶[1]。按照发酵程度的不同，普洱茶可分为普洱生茶和普洱熟茶两大类。消费者普遍认为，普洱生茶具有陈化生香的品质特点[2]，随着贮存年限的延长，市场价格也逐年升高。

普洱生茶在贮存期间化学成分变化不仅取决于贮存时间，同时与仓储环境也有着紧密的联系。不同仓储地区生态环境条件差异较大，所贮存的普洱生茶具有不同的品质和风格特征[3]。普洱生茶按照贮存方式可分为干仓普洱茶和湿仓普洱茶。干仓普洱茶是指将普洱茶贮存在通风、干燥及空气湿度低的环境中，而湿仓普洱茶是指将普洱茶贮存在温度和湿度较高的环境中[4]。目前，在市场上存在着以湿仓普洱茶冒充陈年干仓普洱茶的现象，而且价格较高，极大损害消费者利益，也不利于普洱茶消费者科学贮存。目前关于普洱茶的研究主要集中在不同年份普洱茶理化指标[5]、香气成分[6]、感官审评[7]和抗氧化[8]等方面，而对于在自然条件下干仓和湿仓贮存的普洱茶陈化品质研究较少。高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用能从整体上对普洱生茶进行成分分析与质量评价，已被广泛用于茶叶品质化学的研究领域中[9-12]。正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）可将正交信号校正方法与偏最小二乘法进行结合，滤除与研究对象无关的噪音[13]，主要用于实现差异样品的鉴别[14]和特征标记物的获取[15]。

本研究以勐海茶厂有限公司生产的普洱生茶（7542）（生产时间分别为2008年、2010年、2012年、2014年和2016年）为研究对象，贮存地点分别为新疆乌鲁木齐和广东广州，贮存环境接近普洱茶的干仓和湿仓的贮存要求，通过对样品进行感官审评、分析主要化学成分，结合OPLS-DA模型分析以及变量重要性因子（variable important for the projection，VIP）值以及S-plot图等多元统计方法，找出不同贮存地普洱生茶的特征性化合物，分析这些特征性化合物变化规律。研究结果可为普洱茶科学贮存提供理论支持，也为消费者理性消费提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

普洱生茶（7542）于勐海茶厂有限公司生产，均采用同一标准采摘的云南大叶种加工而成；分别贮存于新疆乌鲁木齐和广东广州仓库中（自然贮存），每个样品选取5 个等间隔年份。样品采集后均贮存于实验室4 ℃冰箱，样品具体信息见表1。

表 1 不同年份普洱生茶样品信息Table 1 Information about raw Pu-erh tea samples tested in this study

广州市地处中国南部，属典型的亚热带季风气候，温暖多雨、温差较小，全年气温都维持在一个相对较高的水平，并且高温（25 ℃）以上的时间在5-10月，是中国年平均温差最小的城市之一，年平均相对湿度72.5%。而新疆乌鲁木齐没有像广州的高温高湿，地处中国西北，是世界上内陆中距离海洋和海岸线最远的城市之一，属温带大陆性干旱气候，全年温差较大，干燥少雨，最热的是7月，月平均气温25.7 ℃，最冷的是1月，月平均气温-15.2 ℃，年平均相对湿度57.3%。

儿茶素（纯度≥99%）、表儿茶素（纯度≥99%）、表没食子儿茶素（纯度≥98%）、表没食子儿茶素没食子酸酯（纯度≥99%）、表儿茶素没食子酸酯（纯度≥98%）、没食子酸（纯度≥99%）、咖啡碱（纯度≥99%） 美国Sigma公司；乙二胺四乙酸二钠北京索莱宝科技有限公司；抗坏血酸、乙醚（化学纯）国药集团化学试剂有限公司；癸酸乙酯（分析纯）上海阿拉丁生化股份有限公司；氨基酸与茶氨酸的混合标样、氨基酸分析专用试剂AccQ.Tag（包括衍生化试剂AccQ.Fluor和磷酸缓冲盐） 美国Waters公司。

1.2 仪器与设备

600高效液相色谱仪、2475荧光检测器、2489紫外-可见光检测器、HPLC Symmetry R C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱分析柱、AccQ.Tag C18氨基酸专用分析柱 美国Waters公司；同时蒸馏萃取装置 中国科技大学玻璃仪器厂定制；N-EVAP-12氮吹仪 美国Organomation公司；7890A-5975C GC-MS联用仪、HP-5（30 m×0.25 mm，0.25 µm）石英毛细管柱 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 主要理化品质测定

1.3.1.1 儿茶素组分和咖啡碱的检测

按照GB/T 8313—2008《茶叶中茶多酚和儿茶素含量的检测方法》[16]中的茶叶中儿茶素类的测定——HPLC法进行。

1.3.1.2 18 种氨基酸单体的测定

按照GB/T 8312—2002《茶叶中游离氨基酸的测定》[17]中要求制备，过0.22 μm滤膜后待衍生化用，采用美国Waters公司AccQ.Tag方法测定氨基酸含量[18]。

1.3.2 香气物质提取及分析

1.3.2.1 提取

称取普洱茶样品20 g置于1 000 mL圆底烧瓶中，加入400 mL纯水，并加入1 mL质量浓度为100 μg/mL癸酸乙酯-乙醚溶液，接入同时蒸馏萃取装置A口，电热套加热煮沸。用量筒量取30 mL乙醚至100 mL圆底烧瓶，接入同时蒸馏萃取装置B口，45 ℃水浴加热。萃取70 min后冷却15 min，将全部乙醚萃取液转移至盛有无水硫酸钠的试管中密封，置于4 ℃冰箱中过夜使萃取液脱水，氮吹使溶剂挥发，浓缩得到1 mL无色透明液体。

1.3.2.2 GC-MS分析

采用Agilent 7890A-5975C GC-MS联用仪，HP-5石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 µm）；进样口温度：200 ℃；检测器温度：280 ℃；升程范围：50～190 ℃，柱箱程序：初始温度50 ℃，然后以2 ℃/min升至190 ℃，运行时间：70 min；载气：He，纯度≥99.999%；柱流速：1 mL/min；进样体积：1 µL；分流方式：不分流。离子源温度：230 ℃，四极杆温度：150 ℃；质量扫描范围：40～600 u。扫描方式：全扫描；溶剂延迟3 min。

1.3.3 定性和定量方法

供试茶样香气成分根据GC-MS分析得到的各色谱峰，通过计算机谱库检索（Wiley和NIST库），结合相对保留时间，查阅有关文献数据进行定性，通过内标法进行相对定量[19]。1.4 数据处理

实验重复3 次，数据以3 次处理的平均值表示。显著性分析采用SPSS 22.0数据软件进行处理，OPLS-DA采用SIMCA-P 13.0数据软件进行处理，柱状图采用Origin 9.1绘制，热图采用MEV 4.9.0绘制。

2 结果与分析

2.1 不同环境条件下贮存时间对普洱生茶感官品质的影响

表 2 贮存于新疆与广东普洱茶样感官审评结果Table 2 Sensory quality of tea samples stored in Xinjiang and Guangdong

从表2可知，广东茶样转化速率整体快于新疆茶样，同一批茶样在两地区贮存一定时间后，感官品质呈现出明显的差异。香气上，新疆仓储茶样香气相对较纯正，在陈化后期，香气整体偏果香。广东茶样陈化过程中出现一定程度的粗、烟味，陈化后期出现陈香。汤色上，两地区茶样总体逐渐变深，转化较快的是广东样，在仓储第3年，汤色由黄绿转化成橙黄，到仓储第9年，汤色转化成橙红。滋味和叶底也出现较大的差异，随着贮存时间的延长，新疆仓储普洱茶滋味由粗涩转化成浓醇，而广东仓储生普洱茶后期转化较快，滋味纯正但醇厚感不足。

2.2 不同贮存环境下普洱生茶差异性化学成分筛选

图 1 普洱生茶OPLS-DA得分图Fig. 1 OPLS-DA score plot of raw Pu-erh raw tea

由图1可以看出，新疆仓和广东仓可显著分成2 部分，这表明两贮存地区普洱生茶主要化学成分存在显著差异。研究中发现，OPLS-DA模型包含7 个主成分，拟合参数R2X=0.967，说明7 个主成分解释96.7% X变量；对因变量的拟合指数R2Y=1，说明5 个主成分解释100%的Y变量；模型预测指数Q2=0.943，说明模型对新疆仓储普洱生茶和广东仓储普洱生茶的预测能力为94.3%，模型的稳定性及预测能力均较好[20]。

图 2 OPLS-DA模型VIP值Fig. 2 Bar plot of VIP for OPLS-DA model

为进一步找出对结果分类起贡献作用的变量，进一步分析2 组数据的整体差异性，得到OPLS-DA VIP值。VIP值可以量化OPLS-DA的每个变量对分类的贡献，VIP值越大，变量在不同贮存地区间的差异越显著。如图2所示，10 个内含成分的VIP值大于1。结果表明，丙氨酸、表儿茶素、没食子酸、精氨酸、苏氨酸、谷氨酸、甘氨酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、茶氨酸、表没食子儿茶素10 种化学成分为贮存在新疆和广东两地普洱生茶差异化学成分。

2.3 不同贮存地普洱茶特征性差异成分比较

图 3 两地贮存普洱生茶的差异性变量分析结果Fig. 3 Differential variable analysisof raw Pu-erh tea samples from different storage areas

对获得的差异性变量在两贮存地区的分布进行统计分析，结果如图3所示。随着贮存时间的延长，贮存在新疆地区普洱茶叶主要化学成分转化速率慢于广东地区，已检测化学成分含量中除没食子酸外均高于广东仓，从第1年贮存到第9年，广东茶样中表没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素和表儿茶素由贮存第1年的97.7、25.5、6.90 mg/g分别下降至61.3、13.4、2.80 mg/g，降幅分别达37%、47%和59%，没食子酸由贮存前的1.60 mg/g上升至3.70 mg/g。从第1年贮存到第9年，广东仓样品中6 种氨基酸（茶氨酸、苏氨酸、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、甘氨酸）含量显著降低，2 种甜味氨基酸（丙氨酸、甘氨酸）在贮存过程中降解消失，研究结果与前人所得结论[21]一致。贮存在新疆地区普洱茶儿茶素总量和氨基酸总量也呈现出下降趋势，其中简单儿茶素（表没食子儿茶素、表儿茶素）呈现上升的趋势，但不同年份之间差异性没有达到极显著水平。

研究表明儿茶素和氨基酸是构成茶汤苦涩味和鲜爽味的主要来源，且参与茶叶香气的形成和转化[22-23]。普洱生茶受两贮存地气候、环境、干湿度等因素的影响，导致儿茶素和各氨基酸成分转化程度不同[24-25]。从本研究检测的儿茶素与氨基酸来看，广东仓普洱生茶从各方面来看，转化速率更快，除没食子酸以外，其他化学成分低于新疆仓储。陈保等[26]通过对成品普洱茶在不同贮存条件的研究，结果表明茶多酚随着贮存时间的延长、贮存温度的升高而下降，且茶叶含水量高者下降幅度大。因此，推测广东地区的高温高湿加速了茶叶中氨基酸、儿茶素等物质的氧化聚合[11]，其中没食子酸含量的升高可能与贮存过程中酯型儿茶素或其他没食子酸衍生物发生水解等反应有关[27]。综合感官审评，随着贮存时间的加长，广东地区的茶样品质转化较快，陈化后期醇厚度下降，品质发生下降。而新疆地区的茶样品质转化较慢，陈化后期保留了较多普洱生茶的醇厚滋味，品质和风味更佳。

2.4 不同贮存环境普洱生茶挥发性成分分析

基于70 个挥发性成分构建新疆仓普洱生茶与广东仓普洱生茶的OPLS-DA得分（图4A）可以看出，新疆仓样品全部位于X负半轴，广东仓样品全部位于X正半轴，且广东仓样品不同年份的坐标点在得分图上位置较远，结果表明两仓储型普洱生茶的挥发性化学组成差异显著，同时广东仓样品不同年份间差异大于新疆仓。OPLS-DA挥发性成分模型主成分回归系数R2X=0.759，R2Y=1.000，Q2=0.952，表明该模型的稳定性及预测能力均达到要求。

为进一步找出两仓储普洱生茶差异性大的挥发性变量，提取OPLS-DA模型中VIP值最大的前29个变量（VIP值＞1），这29 个变量在载荷矩阵图（图4B）和S-plots图（图4C）中距原点都有较大的距离，表明它们对分类的贡献较大。同时观察可知，广东仓样品香气成分数量远远大于新疆仓样品。图4D为OPLS-DA模型中部分变量相关系数柱状图，相关系数的绝对值大小代表其对应变量对OPLS-DA结果的影响，即间接反映两仓储地区普洱生茶相应挥发性成分的差异大小。正值代表其对应的挥发性成分在新疆仓高于广东仓，负值则低于广东仓。以VIP值大于1为界限进行筛选并结合载荷图，S-plots图和相关系数综合分析可筛选出大马士酮、2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-羧醛、α-松油醇、香叶基丙酮、棕榈油酸、β-环柠檬醛、亚麻酸、橙花醇、苯甲醛和亚油酸是影响两地区贮存最重要的10 个变量。

图 4 新疆、广东普洱生茶挥发性成分多元统计分析Fig. 4 Multivariate statistical analysis of volatile components of raw Pu-erh tea samples stored in Xinjiang and Guangdong

2.5 差异性成分在新疆仓与广东仓中的相对含量分析

对获得的10 个差异性较大的挥发性变量在两仓储地区的相对含量进行热图分析，如图5所示，总体而言，广东仓的挥发性物质组成种类及含量高于新疆仓。其中大马士酮、β-环柠檬醛、橙花醇、棕榈油酸和亚油酸这5 种挥发性物质在广东仓检测到，而在新疆仓没有检测到或含量很低。2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-羧醛和香叶基丙酮在新疆仓含量丰富，在广东仓没有检测到或含量很低，α-松油醇、亚麻酸和苯甲醛在广东仓的含量高于新疆仓。

图 5 不同年份生普中特征性香气物质差异Fig. 5 Variations of volatile components in tea samples of different ages

普洱生茶具有独特的香气，不同贮存环境对普洱生茶的影响差异很大。呈香型物质大马士酮、β-环柠檬醛和橙花醇在广东地区检测到，而在新疆地区几乎检测不到。酸类物质（棕榈酸、亚油酸、亚麻酸）同样在广东地区含量显著高于新疆地区。因此推测，高温高湿的环境造成呈香型物质的形成和转化，同时也可以使不饱和脂肪酸过氧化物进一步氧化降解形成酸类物质[28]。

α-松油醇为陈茶特征型香气成分，对普洱生茶的陈香有着直接的贡献[29]，α-松油醇在广东地区含量高于新疆地区，在一定程度上解释了广东茶样陈化后期陈香产生的原因。香叶基丙酮兼具果香和木香，有研究指出该物质能使花香显得更加圆润[30]，该物质仅在新疆贮存茶样检测到，这可能与新疆茶样陈化后期独特的果香有关。普洱茶的香气是由多种香气物质综合作用的结果，各成分之间的协调的例关系才是普洱茶良好品质的基础。

3 结 论

普洱茶陈化速率与贮存环境温度、湿度相关，温湿度高的贮存环境普洱茶陈化速率快，普洱茶陈化速率在广东比在新疆快；相对温、湿度低的贮存条件，普洱茶的品质和香气比温、湿度高的好，普洱茶在新疆地区陈化的品质优于广东地区。

新疆仓与广东仓普洱生茶内含品质成分存在明显差异。广东仓样品内含品质成分（除没食子酸外）明显低于新疆仓，且随着贮存时间的延长，广东仓样品物质降解速率更快。经过OPLS-DA结合VIP值初步筛选出来的标志性差异成分包括表没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、表儿茶素、没食子酸、精氨酸、茶氨酸、苏氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸10 个化合物。

新疆仓和广东仓的普洱生茶挥发性成分差异显著，广东仓普洱生茶呈香型物质种类相对复杂且变化较为剧烈，相对而言，新疆仓普洱生茶呈香型物质组成简单且较为缓慢。通过OPLS-DA与VIP值结合S-plots和相关性分析最终得出大马士酮、2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-羧醛、α-松油醇、香叶基丙酮、棕榈油酸、β-环柠檬醛、亚麻酸、橙花醇、苯甲醛和亚油酸是影响两地区贮存最重要的10 个差异性标志物。