地肤通乳散治疗奶牛乳房炎临床疗效及作用靶点预测

白东东，李新圃，杨 峰，罗金印，王旭荣，李宏胜

(中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所，农业农村部兽用药物创制重点实验室，甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃 兰州 730050)

奶牛乳房炎严重影响奶牛产业发展，其病因非常复杂，是奶牛自身、病原微生物及环境共同作用导致的结果。其中，病原微生物感染，尤其是大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌3种致病菌感染是导致奶牛乳房炎发生、发展的主要原因[1-2]。奶牛乳房炎每年可造成高达350亿美元的经济损失，仅美国1年的损失就高达20多亿美元。国内外学者对该病进行了系统的研究，但由于乳房炎的复杂性，迄今为止，还没有研制出能彻底根除金黄色葡萄球菌﹑无乳链球菌和大肠埃希菌引起的乳房炎的药物[3]。目前，对奶牛乳房炎的治疗还是以抗生素治疗为主，虽然有一定的效果，但由于抗生素的滥用，造成乳汁中药物残留及细菌耐药性等问题[4]。中兽药因其具有抗菌[5]、消炎[6]、提高免疫力[7]等药效，而且低毒、低残留、疗效确切，成为国内外学者研究的焦点。近年来，用网络药理学揭示中药作用机制的研究越来越多，如中药治疗冠心病[8]、抑郁症[9]等，而中兽医在这方面的研究还较少[10-11]。利用网络药理学可以从药物、靶点、疾病整体来分析、挖掘药物信息，具有整体性和系统性的特点，与中兽医学的整体观念不谋而合，因而在基础研究方面具有非常可观的应用前景。

本试验首先选用由兰州畜牧与兽药研究所奶牛疾病创新团队研发的地肤通乳散对奶牛乳房炎主要病原菌进行体外抗菌活性的测定，然后对临床患有奶牛乳房炎的奶牛进行治疗，观察治愈率、有效率等指标，最后利用网络药理学方法揭示其作用机制，为后续深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

患有乳房炎的奶牛选自甘肃省某牛场，共38头。

1.1.2 试验菌株

本试验菌株为兰州畜牧与兽药研究所微生物与免疫课题组提供。质控菌：金黄色葡萄球菌标准株(ATCC29213)；临床分离菌株：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和无乳链球菌。

1.1.3 试剂

营养肉汤培养基(广东环凯生物科技有限公司)，环丙沙星(上海源叶生物有限公司产品)，地肤子、蒲公英等4味中药购自兰州市黄河药材市场。

1.1.4 仪器

GHP-9050隔水式培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)，超净工作台(上海力申科学仪器有限公司)，LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)，微量移液枪(德国Sartorius公司)，电子天平(诸暨市超泽衡器设备有限公司)，J6-HC高速冷冻离心机(美国Backman公司)，HZQ-F100恒温振荡培养箱(哈尔滨市东联生化仪器有限公司)。

1.2 药敏试验

1.2.1 中药药液的制备

取地肤子、蒲公英等4种药材共500 g，加10 L蒸馏水浸泡30 min，煎煮1 h，4层纱布过滤，再加蒸馏水5 L，煎煮30 min，过滤，合并2次滤液，5 000 r·min-1离心30 min，取上清液浓缩至1 g·mL-1，装入生理盐水瓶中，105 ℃ 20 min高压蒸汽灭菌，分装到50 mL的离心管中4 ℃保存。

1.2.2 菌液的制备

将质控菌和临床分离菌各20 μL分别接种到4个2 mL营养肉汤试管中，37 ℃ 120 r·min-1振荡培养12 h，取出后加入生理盐水稀释到1.5×108CFU·mL-1，再用营养肉汤稀释1 000倍，菌液中菌浓度为1.5×105CFU·mL-1。

1.2.3 最小抑菌、杀菌浓度测定

准备好一定量的96孔板，分别在第1、12列中加入180、200 μL培养基，第2～11列中加入100 μL培养基。在第1列中加入地肤通乳散提取物和阳性对照药20 μL，用排枪充分混匀，然后将100 μL转移到第2列，混匀后再吸100 μL转移到第3列，以此类推到第10列，之后将其稀释至1.5×105CFU·mL-1的细菌液，每孔100 μL添加到第1～10列，此时96孔板中第1～10列中地肤通乳散提取物终浓度分别为50.00、25.00、12.50、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10 mg·mL-1，阳性对照药环丙沙星的终浓度分别为5.12、2.56、1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01 μg·mL-1。将96孔板置于37 ℃恒温培养箱中培养12～36 h，观察并记录最低抑菌浓度。当环丙沙星对标准菌株ATCC29213的最小抑菌浓度在规定的范围内时(0.12～0.5 μg·mL-1)，表明细菌液的浓度是合适的。

1.3 临床试验

患病奶牛每日灌服1 000 g地肤通乳散，连续灌服3～5 d，根据临床症状判断其疗效。若奶牛乳汁中絮状物消失，乳房肿胀消失，乳产量恢复正常，乳房触温正常，则为治愈；若奶牛乳汁中絮状物减少，乳房肿胀程度减轻，产奶量有所提高，则为好转；若奶牛症状无变化或絮状物增多、乳汁颜色变黄，难以挤出，乳房肿胀更加明显，甚至乳房中出现硬块等症状更加严重，则为无效。有效率为治愈率与好转率之和。若患病奶牛在治疗期间治愈，则停止给药，转入正常群；若在治疗结束后患病奶牛未治愈或无效，则改用其他药物治疗。

1.4 地肤通乳散治疗奶牛乳房炎作用靶点预测分析

利用BATMAN数据库检索地肤通乳散各味药所有化学成分，打分值设置为≥55，P值<0.05。将筛选出符合条件的地肤通乳散的活性化合物及其对应靶点通过Cytoscape 3.5.0软件构建地肤通乳散化合物—靶点网络图，在NCBI数据库检索“Bostaurus”和“Mastitis”，获取奶牛乳房炎相关的靶点(见表1)，将其和地肤通乳散靶点一起上传于STRING 10.5软件，物种选择为“Bostaurus”，下载互作关系后将数据上传于Cytosacpe软件中的Cytohubba插件中，即得到地肤通乳散于奶牛乳房炎PPI网络图前10的关键靶点，进行分析。

表1 牛乳房炎靶点

续表1

2 结果与分析

2.1 药敏试验结果

由表2可知，环丙沙星对金黄色葡萄球菌标准株ATCC29213的最小抑菌浓度为0.16 μg·mL-1，表明细菌数量符合要求。地肤通乳散可抑制、杀灭奶牛乳房炎病原菌，其中对无乳链球菌的效果最好，最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)均为1.52 mg·mL-1；对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的MIC稍差，为25 mg·mL-1，MBC是MIC的2倍。

2.2 地肤通乳散治疗奶牛乳房炎的临床功效

经地肤通乳散治疗后，38头患病奶牛中，24头治愈，治愈率63.16%，10头奶牛症状好转，有效率可达89.47%。患病奶牛连续治疗3 d就会出现好转，絮状物消失、红肿减轻等，治疗无效的奶牛症状一般会更加严重，转为以热毒为主的乳房炎，此时再治疗应以清热泻火、消肿止痛为主，加金银花、连翘、菊花等。

2.3 地肤通乳散治疗奶牛乳房炎作用靶点预测

利用BATMAN数据库中检索地肤通乳散所有化合物，并进行筛选，共得到21个活性化合物，对应靶点173个，化合物—靶点网络图见图1。通过Cytoscape软件可知，连接靶点大于20个的化合物有三十烷醇、莎草薁酮、广藿香酮、香附子烯、β-蛇床烯、二烯(表3)；连接活性化合物大于3个的靶点有SNW结构域蛋白1、维生素D结合蛋白前体、25-羟基维生素D-1-羟化酶、维生素D3受体和雄激素受体(表4)。

表2 地肤通乳散对3种病原菌的抗菌活性

三角形表示化合物，圆形表示靶点。The triangle represented the compound， circular represented the target.图1 地肤通乳散化合物—靶点网络Fig.1 Compound-target network of Difutongrusan

将地肤通乳散活性化合物靶点与奶牛乳房炎靶点上传于Cytoscape软件中，利用cytoHubba插件对筛选出的枢纽靶点进行分析，结果见图2。

从图2可以看出，筛选出的枢纽靶点包括5’-核苷酸酶前体(5′-nucleotidase precursor，NT5E)、白介素-8(interleukin-8，IL8)、雌激素受体1(estrogen receptor 1，ESR1)、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亚基α(phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit α isoform，PIK3CA)、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亚基β(phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit β isoform，PIK3CB)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、Janus激酶2(janus kinas2，JAK2)、Toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)，原癌基因RelA，NF-κB亚基和趋化因子CXCL12。故预测地肤通乳散可能通过NT5E、IL8、ESR1、PIK3CA和PIK3CB作用于TNF、JAK2、TLR4、原癌基因RelA、NF-κB亚基和趋化因子CXCL12来治疗奶牛乳房炎。

表3 地肤通乳散的靶点连接度大于20的化合物信息

表4 地肤通乳散连接活性化合物连接度大于3的靶点

图2 地肤通乳散治疗奶牛乳房炎的枢纽靶点Fig.2 Core targets of Difutongrusan in the treatment of bovine mastitis

3 讨论

本研究根据中兽医理论组方配伍为地肤通乳散，先对其抗菌活性做了体外试验，然后对患乳房炎奶牛进行治疗，进行治愈率、有效率统计，最后应用BATMAN数据库，STRING、CytoScape软件等筛选出地肤通乳散4种活性成分及相应作用靶点，构建和分析化合物—靶点网络等对地肤通乳散治疗奶牛乳房炎作用机制。

地肤通乳散对奶牛乳房炎主要病原菌大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的抗菌活性较好，但药敏试验仅能证明中药复方体外的抗菌活性。奶牛乳房炎的病因复杂，与奶牛机体、环境和病原微生物均有关系，单从抗菌活性角度来评价药物的临床疗效太单一，故可在临床上筛选患气血瘀滞型乳房炎奶牛进行治疗，观察临床效果。本研究结果表明，应用地肤通乳散治疗患乳房炎奶牛，治愈率为63.1%，有效率为89.47%。本试验中，治愈率、有效率与治疗奶牛头数、治疗天数和天气等原因有关，故待后期提取、给药量、给药天数优化后可能会取得更好的临床效果。

利用数据库对地肤通乳散治疗奶牛乳房炎作用位点进行分析后发现，地肤通乳散可能主要通过三十烷醇、莎草奥酮、广霍香酮、β-蛇床烯和二烯等的靶点5’-核苷酸酶、白介素-8、雌激素受体1、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亚基α、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亚基β等作用于肿瘤坏死因子、Janus激酶2、Toll样受体4、原癌基因RelA、NF-κB亚基和趋化因子CXCL12来治疗奶牛乳房炎。据有关报道，5’-核苷酸酶对肝胆疾病的诊断有较高的特异性[12]，白介素-8可起到抗感染和免疫损伤的作用，患有乳房炎的奶牛血清白介素-8极高于健康奶牛[13]，雌激素受体1也与奶牛泌乳[14]及多种炎症有关。故在后续进一步的临床研究中，可合理设计试验，利用抗体芯片、ELISA等方法检测治疗前后和健康奶牛白介素-8，雌激素受体1等相关靶点的相对含量，用来验证其预测结果。

利用网络药理学可以在一定程度上揭示中药复方治疗人类或动物疾病的活性化合物、作用靶点等，但也存在一定的局限性，从大数据库采集的活性化合物在实际中药剂型中不能全部检测出，即存在“量”的问题，故要使预测结果更加接近实际，应在中药复方确定剂型后检测出可检测到的化合物，再结合口服利用度和类药性筛出活性化合物进行靶点、机制预测，这样结果更具有说服力。