白羽王鸽卵清蛋白关联蛋白Y基因(OVALY)克隆与生物信息学分析

徐小钦，杜 雪，李国勤，4，张 龙，陶争荣，卢立志，4，*

(1.浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所，浙江 杭州310021； 2.西华师范大学 生态研究院，四川 南充637000； 3.南京农业大学 动物科技学院，江苏 南京 210095； 4.农业农村部农产品信息溯源重点实验室，浙江 杭州 310021)

OVALY(ovalbumin-related protein Y)是蛋清中一种常见蛋白，在鸡蛋清中含量很少[1-2]，但在鸽蛋清中却是最主要的蛋白[3]。Guérin-Dubiard等[4]于2005年采用高通量基因组测序的方式，获得了鸡的OVALY基因碱基序列，同时发现该基因存在两种基因亚型。2006年Guérin-Dubiard等[5]运用双向凝胶电泳技术分离鉴定了鸡OVALY蛋白，其分子量大小为53 ku。通过软件预测该蛋白分子量为55 ku，包含21个磷酸化位点和4个N-链接的糖基化位点，造成此种差异的原因尚未知晓。虽然该蛋白在蛋清中含量少，但有研究表明在鸡受精卵孵化第7天的卵清中含量迅速增加，因此推测其可能参与了鸡胚胎发育调控，具体机制尚不明了[6]。2017年Ren等[3]对鸽蛋清蛋白进行分离，利用MALDI-TOF-MS技术进行鉴定，发现OVALY蛋白为鸽蛋清中最主要的蛋白。但关于鸽子OVALY基因及其对应的蛋白的报道鲜有所闻。岩鸽OVALY基因预测序列于2015年已经发布，但其确切序列尚未获得。

为了研究鸽蛋清中最主要蛋白OVALY的编码基因，本试验运用RACE技术获得白羽王鸽OVALY基因全部的cDNA序列，并利用生物信息学数据库和相关软件进行分析，预测其功能结构。

1 材料与方法

1.1 试验材料

白羽王鸽输卵管膨大部组织样本采集自平阳县鳌峰鸽业有限公司，保存于液氮中。

1.2 试验方法

1.2.1 输卵管膨大部中总RNA提取

将适量样本置于盛有液氮的研钵中，迅速研磨直至粉末状，加入Trizol试剂，按照使用说明书进行实验操作，提取输卵管膨大部总RNA。

1.2.2 反转录

反转录实验试剂采用TransScript First-strand cDNA Synthesis SuperMix(TaKaRa，大连)试剂盒。严格按照试剂盒的使用说明书进行操作。

1.2.3OVALY基因克隆

根据岩鸽OVALY(GenBank∶XM_005509738.1)基因的预测序列，设计扩增该基因部分片段引物OVALY-F和OVALY-R，根据获得的OVALY部分片段序列分别设计3′和5′RACE引物，分别为OVALY-3-GSP1、OVALY-5-GSP1和OVALY-5-GSP2(表1)。引物合成由上海英骏生物技术有限公司完成。

根据SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒(TaKaRa，大连)说明书步骤扩增5′-UTR和3′-UTR区域；严格按照pEASY T1 cloning kit试剂盒(TransGen Biotech，北京)使用说明书进行克隆，并将获得的产物进行测序[7]。

1.2.4 蛋白质序列分析

利用NCBI的Blast功能进行氨基酸同源性比对。用在线工具ExPASy-PROSITE和ExPASy-ProtParam(http://www.expasy.org)预测蛋白质的基本理化性质。利用SWISSMODEL软件(http://swissmodel.expasy.org)选择同源建模法构建OlCtpE蛋白的三级结构。用NetNGlyc 1.0预测糖基化位点，用SignalP 4.1预测信号肽。

表1 OVALY基因引物序列

2 结果与分析

2.1 OVALY基因克隆

白羽王鸽OVALY基因cDNA全长为2 068 bp，其中5′非编码序列为180 bp，3′非编码序列为720 bp，开放阅读框为1 164 bp；编码的蛋白分子量约44.19 ku，含氨基酸残基388个(GenBank∶KX230792)。

2.2 与其他物种氨基酸序列比对

通过NCBI中Blast功能，将白羽王鸽的OVALY预测氨基酸序列与其他鸟类的该基因进行比对。发现与朱鹮(Nipponianippon)同源性最高(81%)；与白尾鹰(Haliaeetusalbicilla)、沙鸡(Pteroclesgutturalis)、鸭(Anasplatyrhynchos)、鸡(Gallus)、鹌鹑(Coturnixjaponica)的同源性分别为80%、79%、69%、65%、66%。采用N-J的方法构建蛋白质系统发育树，结果见图1。

2.3 氨基酸构成及性质预测

利用ExPASy-ProtParam在线软件预测OVALY蛋白的氨基酸构成及性质。该蛋白分子量约44.19 ku，氨基酸序列中谷氨酸(Glu)和赖氨酸(Lys)的使用频率最高，分别为10.80%和9.50%，色氨酸(Trp)使用频率最低(0.8%)，其他氨基酸的使用频率见表2。理论等电点约为5.09，其中正电荷氨基酸残基49个，负电荷氨基酸残基63个；蛋白质氨基酸残基亲疏水性约为-0.315，脂溶性指数约为85.67，不稳定系数约为38.00，体外半衰期约为30 h。说明该蛋白为亲脂的碱性蛋白，且在体内稳定存在[8-9]。

图1 系统发育树(N-J)Fig.1 Phylogenetic tree with branch length (N-J)

表2 鸽OVALY氨基酸组成

2.4 高级结构预测

通过PSIPRED预测了白羽王鸽OVALY蛋白的二级结构。该蛋白含有10个α螺旋和14个β折叠，由无规则卷曲连接。利用SWISS-MODEL预测鸽OVALY蛋白的三级结构。3D结构模型如图2所示。

2.5 糖基化和磷酸化位点预测

利用NetNGlyc 1.0 Server在线软件预测OVALY蛋白序列中Asn-Xaa-Ser/Thr三肽概率大于50%的N-连接糖基化位点，共发现了4个，分别位于62、95、215和374处；利用NetOGlyc 3.1 Server在线软件未发现概率大于50%的O-GalNAc连接糖基化位点。利用NetPhoQ2.0server在线软件预测概率大于50%的磷酸化位点，共发现了22个，其中丝氨酸(Ser)15个，分别位于34、52、83、97、99、148、200、261、308、314、318、321、345、355和356处；酪氨酸(Tyr)5个，分别位于16、79、107、235和385处；苏氨酸(Thr)2个，分别位于202和343处。

2.6 蛋白质结构域分析

图2 鸽OVALY蛋白的3D结构图Fig.2 Tertiary structure of pigeon OVALY protein

通过CDD数据库对OVALY蛋白保守结构域进行分析，发现该蛋白具有丝氨酸蛋白酶抑制剂反应中心结构域，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员(图3)。

SignalP4.0在线软件分析，在该蛋白中不具有信号肽区域；利用TMHMM Server v. 2.0软件分析，该蛋白不具有跨膜区域。因此，该蛋白可能通过非经典分泌途径完成分泌。

图3 鸽OVALY蛋白的结构域分析Fig.3 Conserved domain analysis of pigeon OVALY

3 讨论

基因翻译成氨基酸序列后，主要以糖基化和磷酸化进行修饰，在许多生物进程中具有重要作用。研究表明，蛋白的糖基化参与蛋白质折叠、细胞识别、免疫反应等；磷酸化在信号转导、基因表达、细胞周期调控中起到关键性作用[10-14]。具有免疫功能的蛋白大多都含有糖基化修饰位点，在生物医学研究方面具有重要意义[15]。在白羽王鸽和鸡的OVALY蛋白中均含有4个N-连接糖基化位点，磷酸化位点分别为22个和21个，两个物种的该蛋白具有相似的翻译后修饰。蛋白质的翻译后修饰，对蛋白质的结构和功能具有重要作用，因此对被修饰的结构位点进行深入分析具有重要意义。

真核蛋白质分泌包括经典和非经典两种分泌途径。经典分泌途径是指内质网-高尔基体途径，这种途径是大多数蛋白的分泌方式；只有小部分无信号肤的蛋白质不依赖该途径，就能从胞内运输到细胞外，因此叫做非经典分泌蛋白。一般非经典分泌蛋白是相对分子量12～45 ku的小分子蛋白，缺少潜在糖基化位点和信号肽等结构，受温度、能量等影响较大[16]。本研究中白羽王鸽OVALY蛋白序列中不具有信号肽区域和跨膜结构，且分子量大于12 ku，小于45 ku，因此推断该蛋白的分泌方式为蛋白质非经典分泌途径；但是该蛋白又包含了4个潜在糖基化和22个潜在磷酸化位点，故而其分泌方式有待进一步探讨[17]。

经蛋白质保守结构域分析发现，鸽OVALY蛋白具有丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族(Serpin superfamily)特有的反应活性中心，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员。在鸡蛋中共发现了15种丝氨酸蛋白酶抑制剂，而OVALY蛋白就是其一[18]。这些蛋白是鸡蛋结构的重要组成成分(蛋壳、蛋清、蛋黄、卵黄膜等)，其生理功能还需要深入研究[19]。有研究显示，这些蛋白与哺乳动物的对应蛋白具有一定的同源性，可能参与了细胞增殖、卵泡血管形成、禽类胚胎体外发育、蛋壳生物矿化等[20]。在鸡受精卵孵化过程中，OVALY含量变化显著，推测可能是胚胎的胃肠道蛋白酶或蛋黄蛋白酶的抑制剂[21]。鸽的OVALY蛋白是否具有丝氨酸蛋白酶抑制剂生物活性尚未知晓，作为鸽卵中含量最高的蛋白，可能还具有不为人知的潜在功能，需要进行大量深入的研究。