碳化硅量子点荧光标记技术及其生物学应用

2019-05-21孙为云丁紫阳雷腾飞宋月鹏

人工晶体学报 2019年4期

康杰，孙为云，丁紫阳，周喜，雷腾飞，宋月鹏

(1.郑州职业技术学院材料工程系，郑州 450121;2.齐鲁理工学院机电工程学院，济南 250200;3.山东农业大学机械与电子工程学院，泰安 271000)

1 引言

半导体量子点作为一种新型的荧光标记物，在生命科学、生物医学等领域具有及其重要的应用。半导体量子点与传统的有机染料或荧光蛋白相比，具有发射光谱窄、化学及光学稳定性好、发射光色可调、激发范围宽及其表面特异性蛋白耦联水平成熟，为动态显像、实时目标跟踪、原位，DNA检测，生物芯片及传感器等研究提供了新的发展契机[1-2]。

目前，量子点标记技术在人工晶体、生命科学及农业工程技术领域中也是较为前沿的研究方向[3]，量子点标记技术作为一种新型标记技术，在许多领域的应用越来越受到关注。虽然近几年对镉系量子点作为标记材料的标记技术研究较为成熟，但是，CdSe、CdTe、CdS等镉系量子点的细胞毒性与其结构尺寸的难以控制在一定程度上阻碍了其在量子点标记技术及其应用上的进一步发展[4]。近段时间以来，由半导体碳化硅制备出的量子点荧光标记物，因为它的生物相容性、亲水性良好且腐蚀法制备工艺简便而日渐为研究者们熟知[5-6]。

基于此，本文利用一步法制备出新型标记材料碳化硅量子点，利用其水相溶液对有、无根皮苷环境下的串珠镰刀菌进行标记，对该菌长期培养，并对活细胞进行长期荧光成像，以动态监测串珠镰刀菌长期处于根皮苷环境下的生长、分裂机制、深入探索其生长环境中根皮苷含量的多少与其生长态势的相干性，初步探讨了该菌对连作园中苹果幼苗的感染机理。

2 实验

2.1 荧光标记材料SiC量子点的制备

将40%的氢氟酸、65%的浓硝酸以及分析纯硫酸按照V(HF)∶V(HNO3)∶V(H2SO4)=6∶1∶1的体积比配制成腐蚀液。将自蔓延燃烧合成的均质β-SiC粉末经球磨机振动球磨(约6 h)后倒入上述腐蚀液并在室温条件下加以搅拌1 h。静置半小时后抽取上清液并将余下腐蚀液放置在电热鼓风干燥箱中烘干，对其机械研磨后加入适量超纯水配制成溶液，而后放置于超声分散仪做超声处理25 min，将超声空化、粉碎分散后的SiC颗粒悬浮液放置在高速台式离心机中进行一定时间的高速离心层析剪裁，颗粒尺寸相对较大的便由于离心力作用而沉于底部，则上层清液即为小尺寸的碳化硅量子点水相溶液。

2.2 活体细胞试验

在本文中，所使用的串珠镰刀菌是从连作苹果园的腐烂的苹果根中分离提纯出来的。详细培养过程是：

首先，刮取两环冷藏在霉菌恒温箱里的斜面菌种，无菌情况下接种至PD培养基内活化；然后，无菌情况下用量筒分别量菌液(串珠镰刀菌的PD培养基)90 mL、SiC水相溶液30 mL，混合配制成如表1所示四种不同的菌液试样，其中V(菌液)∶V(SiC量子点水相溶液)=3∶1。

表1 串珠镰刀菌菌液处理Table 1 The treatment of fusarium moniliforme sheld lysate

菌液1作为对照组试样，菌液2、菌液3、菌液4则分别为加入碳化硅量子点但不同根皮苷含量的生长环境；然后将四组菌液试样放置在振荡器(恒温28 ℃)中培养一个月，培养期间每天分别从四种菌液试样中抽样、观察(荧光显微镜下)、照相及记录观察到不同时期菌落的分裂和成长情况。

2.3 仪器表征

利用日本JEOL公司生产的H-9500型透射电子显微镜检测碳化硅量子点(粉末)微观结构、微观形貌；利用日本日立公司生产的F-7100型荧光分光光度计测试碳化硅量子点(水相溶液)的激发和发射光谱；利用美国珀金埃尔默公司生产的Frontier型傅里叶变换红外光谱仪分析碳化硅量子点表面亲有机物基团(巯基)的伸缩指纹区；利用德国莱卡公司生产的DMi8-M型倒置荧光显微镜观察经碳化硅量子点标记后串珠镰刀菌活体细胞的生长状况及其侵染苹果幼苗根部过程的动态示踪。

3 结果与讨论

3.1 SiC量子点的发光机理

当颗粒尺寸达到纳米量级的时候，尺寸限制将引起一系列与体相材料不同的性质，如尺寸效应、量子限域效应等，与常规体系和微观体系不同的是，量子点具有许多独特的低维物性，呈现出许多特殊的光学性质；正是由于量子点自身的这些量子效应，才使得量子点具有特殊的光学性能。半导体分为直接带隙半导体和间接带隙半导体两种，而SiC量子点属于后者，因此尺寸效应的影响在其上表现的尤为明显；当量子点受到外界光刺激时，其体材低能级价带上的电子因吸收外界光子增加能量而向高能级的导带跃迁，根据玻尔兹曼分布特性高能级电子极其活跃并且具有向低能级价带跃迁的几率非常大，这种由导带再次跃迁回价带而发射光子的现象即为碳化硅量子点的光致发光。

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图1 不同光照条件下水相碳化硅量子点的颜色 (a)白光激发;(b)320 nm单色光激发;(c)340 nm单色光激发Fig.1 Color of water-phase silicon carbide quantumdots under different illumination conditions(a)excitation under white light;(b)excitation under 320 nm monochromatic light;(c)excitation under 340 nm monochromatic light

3.2 SiC量子点的微观形貌及其光学特性

腐蚀法制备出的碳化硅量子点水相溶液在自然光下呈现RGB值为R:255 G:234 B:180的颜色[9-10]如图1a所示；在暗室中用手提式紫外分析仪对其进行照射，当该分析仪的激发光波长设定为波长为320 nm时，碳化硅量子点水相溶液呈现RGB值为R:196 G:215 B:0的荧光如图1b所示，而当把激发光波长调至340 nm档位时，溶液又呈现RGB值为R:41 G:131 B:177的荧光情况，如图1c所示。碳化硅量子点水相溶液光致发光颜色随外界光照条件(激发光波长)的变化而不同，具体表现为随激发光波长的增加使得量子点光致发光的颜色出现了红移。该结果与宋月鹏等课题组的研究结果相吻合[11-12]。碳化硅的这一多色荧光特性为同时标记同一客体不同部位的组织、同一组织的多个细胞等提供了理论依据。

通过F-7100型荧光分光光度计进一步表征水相SiC量子点的荧光发射光谱，选取五个波长不同、波长间隔相同的激发光，其波长分别为320 nm、340 nm、360 nm、380 nm、420 nm的激发光对一步法制备的碳化硅量子点水箱溶液试样进行激发测试，其室温下光致发光特征发射光谱如图2(a)所示。

图2 (a)SiC QDs不同波长激发光下的发射谱图;(b)SiC QDs水相溶液的TEM照片Fig.2 (a)Emission spectra of SiC QDs under different wave;(b)TEM image of aqueous SiC QDs

当激发光波长由320 nm经340 nm、360 nm、380 nm以相同波长间隔地稳步增加到420 nm，碳化硅量子点荧光强度最大值对应的发射波长则由415 nm红移到450 nm的发射波长，此结果验证了碳化硅量子点的量子限制效应；同时也表明小尺寸碳化硅量子点的光致发光现象。将制备出的碳化硅量子点水相溶液滴到铜网上，而后把它置于高清透射电镜下观察，结果如图2b所示。从图中可以看出，碳化硅量子点纳米颗粒近似呈球形，而且其尺寸分布也十分均匀，直径几乎均在2 nm左右，而SiC体材料激子波尔(Bohr)直径为5.4 nm，根据颗粒尺寸接近或小于体材激子波尔直径便会产生光致发光的原理，在外界光束(波长合适)的激发下该量子点水相溶液可形成极为显著的光致发光现象。

图3 碳化硅量子点的傅里叶变换红外(FTIR)光谱图Fig.3 FTIR spectrum of SiC QDs

在对碳化硅量子点的腐蚀法制备工艺研究初期，李永、范吉阳、孙祥鸣等[5-6,9]都制备出了表面具有羧基、羟基亲有机物基团的碳化硅量子点，这在一定程度上提高了其亲水性、生物相容性；然而，本课题组通过向腐蚀剂中添加适量的耦合剂(分析纯硫酸)，便一步法制备出了表面具有除羧基、羟基外而且还含有巯基(-SH)的碳化硅量子点，图3是碳化硅量子点的傅里叶变换红外线(FTIR)光谱，通过红外光谱图的指纹区可以非常明显的看出，吸收峰为614 cm-1的位置检测到强烈的伸缩振动，而这正是亲有机物基团-SH的伸缩振动指纹区。

巯基的存在不仅使得与其一端连接的碳化硅量子点具有非常强的亲水性，而且更重要的是，巯基的另一端非常容易与特定物质(例如特定蛋白质)结合，由此可知，巯基在碳化硅量子点表面的成功耦合，为以后医学、生物学特异性标记技术的实现及临床应用提供了理论依据和技术支撑。

3.3 串珠镰刀菌的标记与成像

对未添加量子点标记材料的菌液试样(菌液1)、添加量子点标记材料的菌液试样(菌液2)在相同的无菌、恒温条件下培养3 d，滴到载玻片并将其置于DMi8-M型倒置荧光显微镜下进行观察，调节显微镜上的激发光波长档位，把档位拨至蓝光(约340 nm)时对当前视野拍摄照片，其结果如图4所示。

从拍摄结果可以看到，菌液1(无量子点标记材料)在荧光显微镜下视野中不能看到任何菌落及其生长状况如图4a，而菌液2(含量子点标记材料)在荧光显微镜下透出明亮的荧光如图4b。将产生明亮荧光的菌液2试样置于波长为340 nm的激发光下持续1 h,结果发现显微镜视野中菌液2的荧光强度没有丝毫减弱，这表明作为间接带隙半导体的碳化硅量子点，虽然发光效率较低，但相比于有机荧光染料具有极强的抗漂白能力，其光学性能表现极其稳定。这为实现活体细胞及其亚结构的标记奠定了光学基础。

图4 (a)无SiC QDs的菌液1(340 nm的蓝光激发);(b)有SiC量子点的菌液2(340 nm的蓝光激发)Fig.4 (a)Without SiC QDs(excited wavelength 340 nm);(b)with SiC QDs(excited wavelength 340 nm)

图5 经SiC标记的镰刀菌的长时程成像(a)15 d;(b)30 dFig.5 Long-term imaging for fusarium moniliformewhich labeled by SiC QDs (a)15 d;(b)30 d

考察根皮苷对串珠镰刀菌分裂机制、生长的影响必须确保荧光标记材料满足对该菌标记的长时程性，前期研究中，孙祥鸣等[9]利用SiC量子点对出牙短梗霉菌的荧光成像实验中提到了长时程性，宋月鹏等[11]在研究尖孢镰刀菌的分裂机制时也验证了碳化硅量子点的荧光标记长时程性。为此，本实验对试样菌液2进行长时间的培养(10～40 d)，间隔地对试样取样(15 d、30 d荧光成像)，观察其是否也能满足SiC量子点对串珠镰刀菌标记的长时程成像，照相结果如图5所示。

从串珠镰刀菌活体细胞不同培养时间的长时程荧光成像结果中可以直观看出，随着对试样培养时间的延长，SiC量子点已标记串珠镰刀菌的荧光强度随着该菌对溶液的不断吸收、SiC量子点逐步渗入菌内而逐渐增强，使得在荧光显微镜下观测到的该菌的数目和形态更加清晰；通过菌液2(含SiC量子点)与菌液1(无SiC量子点)对比，串珠镰刀菌的菌落数量、分裂形态和发育机理等均未出现明显差异，这表明该荧光标记材料几乎无细胞毒性或毒性极小甚至可以忽略，完全不影响该菌的长发育过程，该试验结果与Sahu等关于碳化硅量子点细胞毒性的研究结果完全一致[13]；同时，Bluet等研究团队更为深入的研究并解释了碳化硅量子点细胞无毒的原因，相比经表面修饰后的镉系量子点其表面物理化学特性简单，此外该量子点在对客体标记的过程中被标记客体吸收后以均匀的形式分布于活体细胞的。碳化硅量子点的无毒(或低毒)为其今后在活体细胞、靶向细胞甚至人体细胞的长时程成像奠定了生物学基础。

3.4 根皮苷环境下串珠镰刀菌的数量及分裂形态的变化

验证了SiC量子点能够成功实现对串珠镰刀菌的长时程示踪成像，深入研究串珠镰刀菌生长速度及分裂形态与有无根皮苷环境的影响以及有根皮苷但其含量不同影响程度的变化状况，经过对同一生长时期(培养20 d)的该菌在有、无根皮苷环境下试样(菌液2、菌液3、菌液4)的取样观察对比，发现根皮苷环境下串珠镰刀菌细胞数量出现较大变化，如图6所示。

图6a、6b、6c分别为菌液2、菌液3、菌液4三试样培养15 d时的荧光成像结果(放大400倍)。从照相结果中可以看出，未添加根皮苷的菌液2的串珠镰刀菌数目很少，而加入根皮苷的菌液3和菌液4的数量明显较多。为了排除观察视野的局限性，对三种试样在荧光显微镜下缩小同样倍数(放大200倍)后再次进行照相，其结果如图6d、6e、6f所示，结果同样表明未添加根皮苷的串珠镰刀菌数量明显少于添加了根皮苷的该菌，初步说明了根皮苷的添加在一定程度上促进了串珠镰刀菌的生长。

考察根皮苷环境对串珠镰刀菌数量影响的同时又发现，添加根皮苷的菌液试样在生长分裂形态、强度方面有着更为显著的特点，图7即为不同菌液(菌液2、3、4)在相同培养条件下培养35 d时荧光显微镜照相结果。

图7照相结果表明，包括初期的分生孢子生长成串珠菌落，进而形成团絮状菌丝这一过程比起未添加根皮苷的串珠镰刀菌菌落，其生长速度要快的多，并且在分裂形态上同样有着较大的区别。这表明无论是在生长速度上或是分裂形态上，根皮苷为该菌提供了一个助长的环境。

将图6a～c与图7a～c两组照相结果做作对比，不同的根皮苷含量对串珠镰刀菌生长态势的影响程度不尽相同，不难发现，1.0 mol/L根皮苷含量的生长环境下串珠镰刀菌数量大于、分裂强度高于0.5 mol/L根皮苷含量的试样。这表明随着添加根皮苷含量的增加(一定范围)，串珠镰刀菌的数量、分裂强度呈上升趋势。

图6 不同根皮苷含量环境串珠镰刀菌的数量变化(a)无根皮苷;(b)0.5 mol/L;(c)1.0 mol/L;(d)无根皮苷(较a缩小2倍);(e)0.5 mol/L(较b缩小2倍);(f)1.0 mol/L(较c缩小2倍)Fig.6 Number changes of fusarium moniliforme in different environments with different content of phloretin at thesame culture time (a)no phlorizin;(b)0.5 mol/L ;(c)1 mol/L;(d)no phlorizin (2 times smaller than a);(e)0.5 mol/L (2 times smaller than b);(f)1 mol/L (2 times smaller than c)

图7 同一培养时间(35 d)不同根皮苷含量的串珠镰刀菌分裂程度变化(a)无根皮苷;(b)0.5 mol/L;(c)1 mol/LFig.7 Change of fission degree of fusarium moniliforme with different content ofphloretin at the same culture time(35 d) (a)no phlorizin;(b)0.5 mol/L;(c)1 mol/L

3.5 串珠镰刀菌对苹果幼苗根部侵染过程

将经碳化硅量子点荧光标记材料稳定标记后的串珠镰刀菌从菌液4(高含量的根皮苷助长了镰刀菌的分裂生长，其吸收的荧光标记材料碳化硅量子点的量也相对较多，便于观察该菌对宿主的侵染过程)中分离提纯，然后将标记后的该菌无菌接种到宿主(苹果植株幼苗)生长的培养液；对其在恒温、无菌条件下长时间(约30 d)培养，并于每天对其取样观察，荧光显微镜下观察不同时段(1 d、5 d、10 d、20 d)根部侵染情况并照相其结果如图8所示。

对培养液接种后的苹果幼苗培养1 d时取样并在荧光显微镜下观察，结果如图8a所示，苹果幼苗根毛附近发出微弱的荧光，这表明串珠镰刀菌对幼苗的侵染已初步开始；5 d时，再次取样观察结果如图8b所示，苹果幼苗根毛区的荧光强度明显加强，这表明根毛已经吸收了大量标记后的串珠镰刀菌，并且已锁定侵染宿主的初始位置为根毛区；10 d时后继续取样观察结果如图8c所示，苹果植株幼苗根部的表皮细胞发出很强的荧光，这表明随着培养时间的延长，根毛吸收的串珠镰刀菌逐渐被该区表皮细胞所摄取；在培养时间达到20 d时，进行最后一次取样，将根须的表皮去除做成切片进行观察，结果如图8d所示，切片在荧光显微镜下发出了剧烈的荧光，这表明串珠镰刀菌已经进入到根须的细胞核，完成了对宿主的侵染。

图8 串珠镰刀菌对苹果幼苗根部侵染过程的动态示踪及成像(a)1 d(b)5 d;(c)10 d;(d)20 dFig.8 Dynamic tracing and imaging of the root of apple tree which infected by fusarium moniliforme(a)1 d;(b)5 d;(c)10 d;(d)20 d

图9 串珠镰刀菌对挫伤后苹果植株幼苗根须的侵染荧光成像(培养5 d)Fig.9 Fluorescence imaging of the injuredroot of apple tree which infected by fusarium moniliforme(5 d cultivating after marked)

为验证串珠镰刀菌侵染宿主(苹果幼苗植株根部为例)的开始位置确实从根毛区开始，在无菌条件下将培养1 d的苹果幼苗根须人为挫伤后放入培养液继续培养，5 d后将挫伤部分根须取样后仍制以切片形式在荧光显微镜下观察，结果如图9所示。

图中被人为挫伤的根须部分为椭圆所圈，而所圈发亮的部分则为串珠镰刀菌因被量子点标记而在显微镜下发出强烈的荧光，很明显该位置仍然是幼苗的根毛区，串珠镰刀菌并没有因为宿主伤口的存在而首先入侵至挫伤部位的表皮细胞，实验结果与A. L. Lagopodi研究的结果完全一致[15]，因此有理由认为：根毛区是植株新陈代谢和吸收养分的重要部位，所以串珠镰刀菌对宿主侵染的初始位置是根毛区。