化瘀祛痰方对急性心肌缺血大鼠心肌组织RhoA、ROCK1 mRNA 表达的影响

李阳， 冷雪

（1.辽宁中医药大学实验动物中心，辽宁沈阳 110847；2.辽宁中医药大学中医脏象理论及应用教育部重点实验室，辽宁沈阳 110847）

急性心肌缺血是由于心脏血液灌注减少，导致心脏供氧降低、心肌能量代谢不正常、不能支持心脏正常工作的一种病理状态，是冠心病等多种心脏疾病的常见症状[1]。现代医学认为，其发病机制与血管舒缩功能[2]、血液流变学[3]、心肌耗氧量[4]等有关，其中RhoA/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1（ROCK1）信号通路是调整血管舒缩功能与血流量的热点通路。前期研究表明，化瘀祛痰颗粒可以通过保护心肌超微结构，抑制心电图J点的抬高，减少J点的回落时间，增加微循环血管横截面积，提高血液中一氧化氮（NO）的浓度，降低血液中内皮素1（ET-1）的浓度来阻抑血小板活化，防止血管痉挛，预防血栓的形成，从而最终起到改善心肌微循环的作用[5]。基于此，为进一步探讨化瘀祛痰方防治急性心肌缺血的作用机制，本研究观察其对急性心肌缺血大鼠心肌组织RhoAROCK1信号通路的影响，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物60只SPF级雄性SD大鼠，体质量200～220 g，7周龄，购自辽宁长生生物技术有限公司，许可证号：SCXK（辽）2015-0001，于辽宁中医药大学实验动物中心适应性饲养，自由饮水，自然光照。

1.2药物与试剂化瘀祛痰方由党参25 g，黄芪25 g，绞股兰15 g，丹参5 g，茯苓10 g，法半夏、石菖蒲、川芎、郁金各5 g组成，由辽宁中医药大学附属医院制剂室提供；单硝酸异山梨酯片（鲁南贝特制药有限公司）。异丙肾上腺素（Iso）（美国Sigma公司）；大鼠ET-1酶联免疫吸附分析（ELISA）检测试剂盒（上海艾莱萨生物科技有限公司）；TRlzon总RNA提取试剂、HiFiScript cDNA Synthesis Kit、UltraSYBR Mixture（康为世纪生物科技有限公司）；引物由武汉金开瑞生物工程有限公司合成，PCR引物序列见表1。

表1 PCR引物序列Table 1 Sequence of PCR primers

1.3主要仪器SpectraMax I3多功能酶标仪（奥地利Molecular Devices公司）；96-Well梯度PCR扩增仪（美国Veriti公司）；7500荧光定量PCR扩增仪（美国ABI公司）；PL3508八通道生理记录仪（澳大利亚AD公司）。

1.4分组与给药大鼠适应性喂养1周后，随机将大鼠分为空白组，模型组，西药组，中药低、中、高剂量组，每组10只。西药组给予单硝酸异山梨酯水溶液灌胃，中药低、中、高剂量组分别对应给予低、中、高剂量的化瘀祛痰方灌胃，正常组、模型组给予等体积生理盐水灌胃，每日1次，连续7 d。化瘀祛痰方剂量按照动物与成人（体质量60 kg）的每kg体质量剂量折算系数表计算（人与大鼠的折算系数为6.25）。化瘀祛痰方低、中、高剂量分别为10.4、20.8、41.6 g·kg-1·d-1。单硝酸异山梨酯片剂量为3.125 mg·kg-1·d-1，现用现配。

1.5动物模型复制参考杨勇等[6]方法造模。实验第7天，给予各组大鼠灌胃给药后30 min，腹腔注射100 g/L水合氯醛，待麻醉成功后使其仰卧于兔台上，除正常组外，给予其余各组大鼠腹腔注射Iso（0.025 mL/kg）复制急性心肌缺血模型，正常组大鼠注射等体积生理盐水。

1.6观察指标与方法

1.6.1 心电图 造模前将大鼠麻醉，后连接八通道多导生理记录仪并将电极插入大鼠四肢皮下，记录大鼠正常心电图。待心电图稳定后注射Iso复制急性心肌缺血模型，再记录2、5、10、15、20、30 min大鼠标准肢体Ⅱ导联心电图变化。计算2、5、10、15、20、30 min心电图ST段偏移的幅度，每个时间点测5个心动周期，取其平均值，以模型组大鼠心电图6个时间点的ST段偏移绝对值之和大于等于0.6 mV作为急性心肌缺血造模成功的标志[7]。

1.6.2 心肌病理学观察 取100 g/L多聚甲醛固定的心肌组织，脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、梯度入水、苏木素—伊红（HE）染色、晾干、封片、镜检。

1.6.3 ELISA法检测各组大鼠血清ET-1含量 测定大鼠心电图后腹主动脉采血，静置2 h，4℃3 000 r/m离心10 min，分离血清，-20℃冷冻备用。具体步骤严格按照ET-1 ELISA试剂盒说明书操作，根据标准曲线及光密度（OD）值计算各组大鼠血清ET-1含量。

1.6.4 qPCR法检测各组大鼠心肌组织RhoA、ROCK1 mRNA水平 称取0.1 g心肌组织，采用Trizol法提取RNA，应用紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度。反转录体系：dNTP Mix 4 μL+Primer Mix 2 μL+RNA+5 × RT Buffer+DTT 2 μL+HiFiScript 1 μL+RNase-Free Water 共 20 μL，以37℃15 min、85℃5 s的条件进行反转录。PCR体系：2× UltraSYBR Mixture 25 μL+Template DNA 2 μL+上下游引物 各1 μL+RNase-Free Water 21 μL共50 μL，按照95℃ 30 s，1个循环，变性95℃5 s，60℃34 s，35个循环的条件进行扩增，得到各孔对应的CT值。采用2-△△CT法，以模型组为1，计算RhoA、ROCK1 mRNA的相对表达水平（p）。

1.7统计方法采用SPSS 19.0统计软件对实验数据进行分析，数据结果以均数±标准差()表示，若正态分布、方差齐性，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐采用LSD法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组大鼠心肌组织结构比较图1结果显示：与空白组比较，模型组心肌纤维大片断裂，间质可见明显出血；与模型组比较，西药组，中药低、中、高剂量组心肌纤维断裂改善，间质出血减少。

图1 各组大鼠心肌组织病理变化比较（HE，×400）Figure 1 Comparison of the pathological features of myocardial tissues in various groups（by HE staining，× 400）

2.2各组大鼠心电图ST段偏移比较表2结果显示：与空白组比较，模型组心电图ST段偏移值升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组心电图ST段总偏移值均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组大鼠心电图ST段总偏移值比较Table 2 Comparison of the total ST-segment deviation in ECG of various groups ()

表2 各组大鼠心电图ST段总偏移值比较Table 2 Comparison of the total ST-segment deviation in ECG of various groups ()

①P＜0.05，与空白组比较；②P＜0.05，与模型组比较

N组别空白组模型组西药组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组10 10 10 10 10 10 ST段总偏移（V/mV）0.13±0.05 0.91±0.07①0.29± 0.09①②0.57± 0.08①②0.43± 0.11①②0.35± 0.08①②

2.3各组大鼠血清ET-1含量比较表3结果显示：与空白组比较，模型组血清ET-1含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组血清ET-1含量均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 各组大鼠血清ET-1含量比较Table 3 Comparison of the serum content of ET-1 in various groups ()

表3 各组大鼠血清ET-1含量比较Table 3 Comparison of the serum content of ET-1 in various groups ()

①P＜0.05，与空白组比较；②P＜0.05，与模型组比较

组别空白组模型组西药组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组ET-1[ρ/（μg·L-1）]233.53±27.21 328.63±29.16①296.43±33.64②268.15±45.64②259.12±38.19②271.64±46.29②N 10 10 10 10 10 10

2.4各组大鼠心肌组织RhoA、ROCK1 mRNA水平比较表4结果显示：与空白组比较，模型组RhoA mRNA表达水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组RhoA mRNA表达水平均降低（P＜0.05）。与空白组比较，模型组、西药组ROCK1 mRNA表达水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组ROCK1 mRNA表达水平均降低（P＜0.05）。

表4 各组大鼠心肌组织RhoA、ROCK1 mRNA表达水平比较Table 4 Comparison of the mRNA expression levels of RhoA and ROCK1 in myocardial tissues of various groups（，p）

表4 各组大鼠心肌组织RhoA、ROCK1 mRNA表达水平比较Table 4 Comparison of the mRNA expression levels of RhoA and ROCK1 in myocardial tissues of various groups（，p）

①P＜0.05，与空白组比较；②P＜0.05，与模型组比较

组别空白组模型组西药组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组N RhoA mRNA 0.13±0.04 ROCK1 mRNA 0.10±0.01 10 10 10 10 10 10 1①1①0.53± 0.04①②0.21±0.03②0.24±0.07②0.16±0.06②0.34± 0.09①②0.33±0.02②0.21± 0.02①②0.18± 0.07①②

3 讨论

一般认为“脾虚生痰、痰瘀互结”是心肌缺血的基本病机[8]。脾虚则痰浊内生，气血津液化生障碍，痰瘀阻络，导致气机不利，气滞则血瘀，痰瘀互结，血脉闭阻，从而引发心肌缺血，出现胸闷、头晕目眩、痰多而粘、食少纳呆、舌质暗、苔腻，舌下络脉迂曲、脉弦、滑或涩等痰瘀症状[9]。化瘀祛痰方由党参、黄芪、丹参、绞股蓝、茯苓、石菖蒲、郁金、川芎、法半夏等组成。方中党参、绞股蓝健脾益气，配以茯苓健脾渗湿，使湿无所聚，痰无由生；丹参、川芎活血祛瘀，佐以石菖蒲、郁金、法半夏，化痰和胃，活血行气，使气机畅通。诸药合用，使瘀化则津液自通，痰邪自散，痰散则脉络通利，瘀不能生，具有益气健脾、祛痰化瘀之功效[10]，与“脾虚生痰、痰瘀互结”之心肌缺血证候相合。但其具体作用机制尚不明确。

有研究表明，急性心肌缺血的发生与RhoA/ROCK通路密切相关[11]。RhoA/ROCK1信号通路是心血管疾病研究的新靶点，激活该通路具有抑制血管收缩、调整内皮功能的作用[12]。其中ET-1是强烈的收缩血管的物质，是RhoA/ROCK信号通路重要的激活因子[13]。RhoA是Rho 3个亚型中研究最多的一个[14]。ROCK是RhoA激酶，分为ROCK1和ROCK2 2个亚型，ROCK1在心肌、血管、肺、脾、肝、肾中表达，其调控平滑肌收缩的主要底物是肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP）[15]。正常情况下，ET-1通过刺激G蛋白偶联受体使与GDP结合的RhoA转化为与GTP结合的RhoA，当RhoA被激活后传递活化信号活化ROCK1，使MLCP磷酸化，促使肌球蛋白轻链（MLC）的磷酸化程度升高，心肌收缩[16]。

本研究结果显示：急性心肌缺血模型大鼠心肌组织出现纤维大片断裂，间质明显出血，血清ET-1含量与心肌组织RhoA、ROCK1 mRNA表达水平升高。提示造模过程中可能过度激活了RhoA/ROCK1通路，促使心肌异常收缩，心肌血流量减少，引起心肌缺血。而经7 d的预灌胃给药后，中药各剂量组心电图ST段总偏移值降低，心肌组织纤维断裂及间质明显出血的情况明显改善，大鼠血清ET-1含量与心肌组织RhoA、ROCK1 mRNA表达水平下降。提示化瘀祛痰方对急性心肌缺血大鼠具有防治作用，其机制可能与抑制大鼠心肌RhoA/ROCK1信号通路相关蛋白RhoA、ROCK1 mRNA表达，抑制心肌收缩，增大心肌血流量有关。

综上所述，化瘀祛痰方可能是通过降低大鼠血清ET-1含量，降低RhoA/ROCK1信号通路中RhoA、ROCK1 mRNA表达水平，改善急性心肌缺血的心肌组织结构，达到防治急性心肌缺血的目的。