甘胆酸试剂盒的性能评价

李忠信，谢茜，周方方，付光宇(通信作者)

郑州安图生物股份有限公司 (河南郑州 450016)

近年来，磁微粒化学发光免疫分析技术结合化学发光免疫检测技术和磁微粒载体技术的优势，使得免疫检测灵敏、快速、准确及特异度强，因此得到了快速发展。本公司应用磁微粒化学发光免疫分析技术在血清甘胆酸的免疫检测上，评价肝细胞功能及其肝胆系物质循环功能。甘胆酸是肝胆疾病的主要诊断指标，近年来文献[1-2]报道该项目与肝纤维化血清标志物联合检查在肝损伤、肝癌、肝硬化等疾病方面具有较高的诊断价值，例如妊娠肝内胆汁淤积症(ICP)患者甘胆酸、血脂水平变化显著，可以作为ICP诊断敏感可靠的指标，对ICP的早期诊断及检测具有重要的临床意义[3]；刘茵等[4]认为血清甘胆酸是评价肝细胞功能及肝胆系物质循环功能的敏感指标之一，肝炎后肝硬化患者甘胆酸水平明显升高。王昉等[5]认为血清甘胆酸可较为灵敏地反映新生儿肝功能病变，对新生儿高胆红素血症的诊断具有重要价值。张有涛等[6]认为甘胆酸可反映肝细胞的受损程度及肝损害的动态过程，对肝脏疾病的判断和治疗具有重要的诊断价值。

甘胆酸是胆酸与甘氨酸结合而成的结合型胆酸之一，相对分子质量为465.6。肝细胞受损时，摄取甘胆酸能力下降，致使血液中甘胆酸含量增高；胆汁郁滞时，肝脏排泄胆酸发生障碍，返流血液循环的甘胆酸增高，使得血清甘胆酸含量增高[7]。因此，测定血清甘胆酸是评价肝细胞功能及其肝胆系物质循环功能的敏感指标之一，且在甘胆酸与血清Ⅳ型胶原、透明质酸、前白蛋白(PA)进行动态联合检查对肝损伤、肝癌、肝硬化、肝胆胃肠消化系统及预后判断等方面具有极其重要的诊断价值[8]。

本公司旨在为临床慢性肝炎、轻度肝硬化、肝癌等疾病的诊断提供可靠的分析指标，建立一种灵敏度高、速度快、准确度高及特异度强的甘胆酸磁微粒化学发光免疫分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料

试剂盒为郑州安图生物工程股份有限公司自制；参比试剂盒为苏州博源医疗科技有限公司试剂盒；仪器为安图生物Autolumo A2000全自动化学发光测定仪。

1.2 方法

1.2.1灵敏度建立方法

根据EP17-A2[9]选择5份接近0值的临床样本，每个样本测定3次，测定4 d，进行空白限(LOB)的建立。选择1～4倍LOB的5份临床样本，每个样本测定3次，测定4 d，进行检出限(LOD)的建立。

1.2.2准确度评估方法

1.2.3试剂盒精密度评估

根据EP05-A3[11]，评估试剂盒的批内、批间及总不精密度。

1.2.4试剂盒线性范围评估方法

根据CLSI EP06-A[12]文件，建立本试剂盒的线性范围。选择线性范围上限100%～130%的临床样本10份，用低值样本依次稀释制备10个系列的评价样本(每个样本测定4次)。

采用平均斜率法分析实验结果，以X表示各样本的预期值，以Y表示各样本的实测均值，形成10对预期值、实测值，用直线回归对数据进行处理，得到10组线性回归方程(表1)。

1.2.5药物干扰

于临床样本中添加25种临床常见治疗药物，检测25种临床常见治疗药物对检测结果的干扰。

1.2.6参考值范围的确定

根据EP28-A3C[13]，采用本试剂盒建立一个足够可靠和实用的参考区间。利用医学统计软件SPSS 19.0，采用K-S检验，样本检测值呈正态分布。故采用95%百分数范围的正态分布法，建立参考值范围。

2 结果

2.1 试剂盒的灵敏度

选用“1.2.1”的实验方法，本试剂盒的LOB为0.05 μg/ml，LOD为0.30 μg/ml，功能灵敏度(FS)为0.40 μg/ml。

2.2 试剂盒的准确度

选用“1.2.2”的实验方法，本试剂盒的回收率为85.20%～113.40%。

2.3 试剂盒的精密度

选用“1.2.3”的实验方法，3批试剂盒的批内精密度<8% ，批间精密度<10%，总不精密度<15%。

2.4 线性范围的建立

选用“1.2.4”的实验方法，建立本试剂盒的线性范围。表1为10份样本的线性回归方程和线性相关系数R2。

表1 10份样本的线性回归方程

在完全理想状态下，实测值和预测值间的回归线为通过原点、斜率为1的直线，即斜率b1为1，截距b0为0。由表1可知，10份样本回归方程b1在1.00±0.03范围内，b0近于0。通过表1进行分析，确定线性范围1～50 μg/ml。

2.5 临床治疗药物影响评估

于临床样本中添加25种常见治疗药物，25种药物对本试剂盒检测结果无干扰，临床偏差在8%以内。

2.6 试剂盒的参考值范围

由于个体差异及地域、年龄和性别的不同，不同人血清中的甘胆酸含量会有一定的差异。选用“1.2.6”的实验方法，本试剂盒建立的参考值范围为0～2.7 μg/ml。该参考值范围与苏州博源医疗科技有限公司一致。

2.7 临床研究

使用本试剂盒与苏州博源医疗科技有限公司试剂盒同时测定604份临床样本，对实验结果进行泊松相关系数分析，回归方程Y=0.9515X-0.3613，相关系数R2=0.9018。

3 讨论

在本试剂盒性能指标的建立过程中，建立了灵敏度、线性范围、回收率、精密性、参考值范围等性能指标。肝纤维化四项1 000 ng/ml透明质酸、100 ng/ml Ⅲ型前胶原氨端肽、1 000 ng/ml Ⅳ型胶原和800 ng/ml层粘连蛋白，以及400 μg/ml孕酮、170 μg/ml睾酮对本试剂盒检测结果无影响，另外25种临床诊断药物对本试剂盒的检测也无影响，这些性能指标保证了检测结果的准确、可信。

苏州博源采用均相酶免疫法进行测定，存在一定的方法学限制，灵敏度、精密性较低。本研究采用磁微粒全自动化学发光免疫分析方法，灵敏度和精密性得到显著提升。

在临床研究过程中，本试剂盒与参比试剂盒测定值高度相关，即该试剂盒与参比试剂盒的测定结果具有较高的符合度，具有同等的临床诊断价值。甘胆酸对于肝病样本的检出率为60%左右，肝病和肝硬化样本的阳性率大致相同，联合肝纤维化四项检测意义重大，有助于临床医师对结果进行解读。在人体内甘胆酸正常代谢途径为肠-肝循环，甘胆酸由肝细胞合成，经毛细胆管、胆管排入胆囊，随同胆汁进入十二指肠[8]，因此甘胆酸与肝脏关系极为密切。肝脏的代谢与摄取能力将直接影响体内甘胆酸的水平，肝病患者的肝脏代谢与摄取能力降低，因此体内甘胆酸含量显著升高，试剂盒检测结果与临床诊断结果一致。

综上所述，本研究建立的甘胆酸磁微粒化学发光定量免疫分析方法灵敏度高、测定速度快、准确度高及特异度强，利于临床研究的开展，可为多种疾病的临床治疗提供可靠的性能指标。