不同浓度多西环素对碱烧伤大鼠角膜中转化生长因子β1和基质金属蛋白酶9表达的影响△

易琼 邹文进

眼睛的化学损伤占眼外伤的11.5%～22.1%，最常见的原因是从职业中接触碱[1]。碱能够迅速穿透眼前部，造成广泛的组织损伤，引起角膜感染、溃疡、穿孔、新生血管形成和混浊[2]。近年来研究认为，在影响角膜碱烧伤愈合反应的众多细胞因子中，转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)在受损组织的再生中起关键作用，特别是TGF-β1[3]，它能诱导基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的表达，进一步促进胶原纤维的降解[4]。因此，降低TGF-β1和MMP-9的表达可能有利于碱烧伤后角膜的恢复。本课题组前期已经证明，多西环素对碱烧伤大鼠角膜炎症细胞浸润及新生血管形成均有抑制作用[5-6]，但是尚未清楚多西环素对TGF-β1和MMP-9的作用。因此，本研究以大鼠角膜碱烧伤为模型，观察不同浓度多西环素对碱烧伤后大鼠角膜中TGF-β1及MMP-9表达的影响及相互作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组健康雄性SPF级SD大鼠50只，体质量(200±20)g，由广西医科大学动物中心提供。实验前通过裂隙灯检查排除眼前节疾病。采用随机数字表法将大鼠分为对照组、0.5 g·L-1多西环素组、1.0 g·L-1多西环素组，均以右眼为实验眼，剔除造模后角膜穿孔、前房积血等的5只(5眼)大鼠。每组15只15眼。实验遵循国家实验动物管理保护条例。

1.1.2 主要试剂及仪器显微手术器械(上海医疗器械)；眼科显微镜(日本Olympus公司)。多西环素粉剂 (Doxycycline，美国 Sigma 公司)；Trizol核酸蛋白提取试剂、cDNA合成试剂盒、2×Taq PCR MasterMix以及引物(日本TaKaRa公司)；TGF-β1蛋白ELISA试剂盒及MMP-9蛋白ELISA试剂盒(武汉华美生物)。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠角膜碱烧伤模型的制备各组大鼠均右眼造模。碱烧伤模型建立前1 d用5.0 g·L-1妥布霉素眼液滴眼预防感染，每天4次。腹腔内注射100 g·L-1水合氯醛(4 mL·kg-1体质量)麻醉大鼠，丁卡因滴眼行表面麻醉，棉签擦干结膜囊内液体。自制碱烧伤模具：200 μL容积的枪头距尾部15 mm处水平切去枪头前端，用刀片小心将切口端外部削薄，在枪头内填塞适量棉花，使枪头切口端外露的棉花形成一个平整微凸面，松紧度适中，枪头尾部用纸胶布封贴，高压高温灭菌备用。于模具内滴入200 μL 1 mol·L-1NaOH，将模具垂直放置于大鼠右侧角膜中央25 s，迅速用 20 mL生理盐水冲洗烧伤区及结膜囊1 min，冲洗完毕后可见角膜中央有一圆形灰白色烧灼斑，直径约4 mm。模型成功标准：角膜基质层水肿、混浊明显，虹膜隐约可见。碱烧伤后立即给予眼液滴眼，三组分别用眼液溶媒、0.5 g·L-1多西环素、1.0 g·L-1多西环素滴右眼，溶媒除不含多西环素外，其余成分均与多西环素眼液相同，每天4次，每次20 μL，至临床观察期结束。

1.2.2 活体观察造模成功后，每天滴药前用显微镜观察眼前段大体情况，并于角膜碱烧伤后第3天、第7天、第14天对各组大鼠右眼进行角膜混浊程度评分。角膜混浊程度的评分参照Holland等[7]的标准：0分：角膜透明无混浊；1分：角膜轻度混浊，虹膜纹理可见；2分：角膜混浊较重，虹膜纹理不清；3分：角膜混浊进一步加重，但可见瞳孔；4分：角膜完全混浊，看不清瞳孔。

1.2.3 RT-PCR检测角膜中TGF-β1和MMP-9 mRNA的表达分别于碱烧伤后第3天、第7天、第14天每组随机选取5只大鼠处死，无菌条件下沿角巩膜缘剪下右眼角膜组织，将角膜组织分成两等份，一份迅速存贮于-80 ℃冰箱备用，一份放于装有裂解Buffer Rl的1.5 mL离心管内进行匀浆，采用Trizol法测定各角膜组织中提取的RNA浓度及纯度，通过逆转录试剂盒逆转录成cDNA，进而利用cDNA进行扩增。PCR反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s；TGF-β1、MMP-9和GAPDH均为40个循环。各指标mRNA的相对表达量使用2-△△Ct计算。

1.2.4 ELISA检测角膜中TGF-β1和MMP-9蛋白含量从-80 ℃冰箱取出各组碱烧伤后第3天、第7天、第14天的另一份角膜进行组织匀浆，-20 ℃过夜，反复冻融2次后于低温离心机5000 r·min-14 ℃ 离心5 min，取上清备用。按照试剂盒说明操作行ELISA检测。用酶标仪在450 nm波长测量各孔吸光度(A)值。

2 结果

2.1 活体观察角膜混浊度碱烧伤后第3天：3组角膜基质均明显水肿、混浊，角膜上皮缺损，虹膜纹理不清，3组间角膜混浊程度评分差异无统计学意义(F=1.40，P=0.28)。碱烧伤后第7天：对照组角膜混浊，隐约可见瞳孔，3组间角膜混浊程度评分差异有统计学意义(F=14.80，P=0.00)，且1.0 g·L-1多西环素组角膜混浊程度轻于0.5 g·L-1多西环素组，2组又均轻于对照组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。碱烧伤后第14天：对照组可见新生血管长入混浊区，看不见瞳孔，3组间角膜混浊程度评分差异有统计学意义(F=37.00，P=0.00)，且1.0 g·L-1多西环素组角膜混浊程度轻于0.5 g·L-1多西环素组，2组又均轻于对照组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。1.0 g·L-1多西环素较0.5 g·L-1多西环素更能减轻角膜混浊程度，为最佳浓度。见图1、表1。

图1 大鼠角膜碱烧伤后不同时间点3组角膜混浊情况

表1 大鼠角膜碱烧伤后不同时间点3组角膜混浊程度评分比较

组别角膜混浊程度评分/分碱烧伤后第3天碱烧伤后第7天碱烧伤后第14天对照组2.00±0.71 3.40±0.55 3.20±0.45 0.5 g·L-1多西环素组1.80±0.45 2.80±0.45∗ 2.20±0.45∗1.0 g·L-1多西环素组1.60±0.55 2.00±0.00∗△ 0.60±0.55∗△

注：与对照组相比，*P<0.05；与0.5 g·L-1多西环素组相比，△P<0.05

2.2 各组TGF-β1、MMP-9 mRNA相对表达情况碱烧伤后第3天、第7天，0.5 g·L-1多西环素组、1.0 g·L-1多西环素组TGF-β1、MMP-9 mRNA相对表达量均低于对照组，且1.0 g·L-1多西环素组低于0.5 g·L-1多西环素组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。碱烧伤后第14天，TGF-β1 mRNA的相对表达量在各组间差异有统计学意义(P<0.05)，且1.0 g·L-1多西环素组低于0.5 g·L-1多西环素组，2组又均低于对照组(均为P<0.05)；MMP-9 mRNA的相对表达量3组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表2和表3。

2.3 各组TGF-β1、MMP-9蛋白表达情况碱烧伤后第3天、第7天，0.5 g·L-1多西环素组、1.0 g·L-1多西环素组TGF-β1、MMP-9 蛋白表达量均低于对照组，且1.0 g·L-1多西环素组低于0.5 g·L-1多西环素组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。碱烧伤后第14 天，TGF-β1蛋白的表达量在各组间差异有统计学意义(P<0.05)，且1.0 g·L-1多西环素组低于0.5 g·L-1多西环素组，2组又均低于对照组(均为P<0.05)；MMP-9蛋白的表达量3组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表2和表3。

表2 大鼠碱烧伤后不同时间点3组角膜组织中TGF-β1 mRNA和蛋白表达情况

组别TGF-β1 mRNA相对表达量碱烧伤后第3天碱烧伤后第7天碱烧伤后第14天TGF-β1 蛋白表达水平/ng·L-1碱烧伤后第3天碱烧伤后第7天碱烧伤后第14天对照组1.01±0.201.03±0.261.01±0.14115.27±3.82120.27±7.37104.44±2.980.5 g·L-1多西环素组0.56±0.09∗0.66±0.03∗0.58±0.07∗86.93±3.48∗88.93±3.35∗85.36±3.09∗1.0 g·L-1多西环素组0.36±0.06∗△0.44±0.04∗△0.31±0.08∗△71.76±2.10∗△77.05±4.46∗△70.95±4.68∗△

注：与对照组相比，*P<0.05，与0.5 g·L-1多西环素组相比，△P<0.05

表3 大鼠碱烧伤后不同时间点3组角膜组织中MMP-9 mRNA和蛋白表达情况

组别MMP-9 mRNA相对表达量碱烧伤后第3天碱烧伤后第7天碱烧伤后第14天MMP-9蛋白表达水平/ng·L-1碱烧伤后第3天碱烧伤后第7天碱烧伤后第14天对照组1.00±0.111.01±0.181.00±0.111005.15±17.231210.76±29.67772.82±24.210.5 g·L-1多西环素组0.40±0.03∗0.60±0.04∗0.88±0.10588.79±54.49∗974.41±97.60∗795.90±27.141.0 g·L-1多西环素组0.30±0.03∗△0.43±0.03∗△0.88±0.11427.35±57.46∗△765.06±36.31∗△802.16±23.83

注：与对照组相比，*P<0.05，与0.5 g·L-1多西环素组相比，△P<0.05

3 讨论

角膜碱烧伤后，TGF-β1分泌增加，其与细胞表面受体结合，启动多个信号转导级联反应[8]，还可以诱导成纤维细胞分化为α平滑肌肌动蛋白阳性的肌成纤维细胞，从而导致视力损伤[9]。此外，TGF-β1还可以诱导其他细胞因子的表达，如MMP-9、血管内皮生长因子和单核/巨噬细胞趋化蛋白-1，它们分别参与基质溶解、局部新生血管形成和炎症的形成，TGF-β1的过度表达会加剧受损角膜的损伤[3，8]。Tovey等[10]研究表明，角膜碱烧伤后TGF-β1在角膜组织中表达上调，阻断TGF-β1分泌可以预防角膜损伤后的纤维化，保护患者的视力。

MMPs是锌和钙依赖性内肽酶家族，其分为四大类：(1)胶原酶：可识别Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型天然原纤维；(2)明胶酶：可降解变性胶原(明胶)和基底膜成分；(3)间质溶解素：可识别各种胶原蛋白和蛋白多糖，并激活其他MMPs；(4)膜型：可与细胞表面受体结合，并参与各种细胞周围活动[11-12]。角膜中MMPs的研究几乎可以追溯到1962年Gross和Lapiere对胶原酶活性的首次表述。在这一发现后的几年内，报道出现了碱烧伤后兔和牛角膜中的胶原水解活性，这种类型的伤害导致慢性角膜溃疡，其特征在于角膜胶原基质组织的破坏[13-14]。MMP-9是由基底角膜上皮细胞合成和分泌的主要MMP，其表达在角膜损伤数天内迅速上升，2～4周后消失，主要参与基底膜的降解，其对基底膜的降解可导致角膜上皮再生的失败和促进基质的致病性溃疡和穿孔[15]。

本研究结果表明，碱烧伤后第3天，角膜上皮缺损，角膜水肿，虹膜纹理不清，3组之间角膜混浊程度评分差异无统计学意义(P>0.05)；碱烧伤后第7天、第14天多西环素产生作用，0.5 g·L-1多西环素组、1.0 g·L-1多西环素组均较对照组角膜混浊程度明显减轻，且1.0 g·L-1多西环素组角膜混浊程度轻于0.5 g·L-1多西环素组，3组间角膜混浊程度评分差异均有统计学意义(均为P<0.05)。0.5 g·L-1多西环素组角膜混浊程度虽然较对照组有所好转，但还是影响视力，仅1.0 g·L-1多西环素组角膜几乎恢复透明，治疗效果理想。

多西环素对TGF-β1和MMP-9的调节作用已有研究，Yang等[16]发现，多西环素可抑制TGF-β和MMP-9在动脉瘤中的表达，从而改善内皮依赖性舒张，改善弹性纤维组织。Pflugfelder等[17]研究表明，多西环素通过与MMP-9结构中心内的锌或钙原子相互作用而起到MMP的非竞争性抑制剂的作用，从而降低MMP-9的表达。本研究结果表明，0.5 g·L-1多西环素组、1.0 g·L-1多西环素组在角膜碱烧伤后第3天、第7天与对照组相比均能降低角膜中TGF-β1、MMP-9 mRNA和蛋白的表达水平，且1.0 g·L-1多西环素组较0.5 g·L-1多西环素组更低，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，提示其效应呈一定程度的剂量依赖关系。这与Kim等[18]提出的维生素A可以抑制大鼠角膜碱烧伤中TGF-β1和MMP-9的表达从而促进伤口的愈合，抑制大鼠角膜碱烧伤后角膜降解和角膜混浊的形成结果一致。Corrales等[19]发现，多西环素可以降低MMP-9 mRNA的转录水平并阻止炎症细胞因子白细胞介素-1和肿瘤坏死因子-α的增加。此外，本研究结果表明，碱烧伤后第3天、第7天，MMP-9与TGF-β1的表达趋势相似，提示二者在角膜碱烧伤病理发展中存在依赖性或相关性。Kim等[20]实验表明，TGF-β1可浓度依赖性地通过激活人角膜上皮细胞中的信号通路来增加MMP-9的表达，而多西环素可以抑制这种TGF-β1刺激的MMP-9的表达。因此说明，在碱烧伤病理发展过程中，很可能是多西环素首先抑制了TGF-β1的活性再进一步使MMP-9的表达降低，进而抑制角膜基底膜的降解，促进角膜的愈合。碱烧伤后第14天，多西环素组角膜的混浊程度和TGF-β1的表达水平均明显低于对照组，但MMP-9的表达3组间无明显差异，这可能是因为角膜的损伤愈合反应接近完成，而多西环素可能直接通过抑制TGF-β1的表达减少角膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，从而减轻角膜的混浊程度。

总之，本研究初步显示，多西环素对碱烧伤大鼠角膜中TGF-β1及MMP-9的表达有抑制作用，并呈一定程度的剂量依赖性；多西环素很有可能通过抑制成纤维细胞转化为肌成纤维细胞、抑制基质的降解从而促进碱烧伤角膜的修复。本研究结果为多西环素在大鼠碱烧伤中的应用研究提供了一定的依据和基础。