全二维气相色谱/飞行时间质谱分析传统工艺与机械化工艺老白干原酒的挥发性成分

马雅杰 郑福平* 黄明泉 张煜行 张福艳 孙宝国

（1 北京工商大学 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心 北京100048 2 北京工商大学 食品质量与安全北京实验室 北京100048 3 河北衡水老白干酿酒（集团）有限公司 河北衡水053000）

白酒是中国的国酒。目前已定型的白酒主要香型有12 种[1]。白酒挥发性成分十分复杂，据统计目前已在白酒中检测到1 737 种[2]，这些挥发性成分含量不足2%。这2%的成分决定白酒在香气、口味、 酒体等方面的特征，即决定酒的品质和典型性。挥发性物质的种类与含量与酿酒原材料、发酵工艺、蒸馏和陈酿工艺等密切相关。2015年全国规模以上白酒企业1 563 家，全国白酒总产量1 312.80 万kL，销售收入5 558.86亿元[3]。普遍存在生产工艺机械自动化水平低，劳动强度大，能源消耗高，批次质量不稳定等问题。随着土地资源日益紧张，能源消耗愈加严重，原料和劳动力成本不断攀升，生产环境要求更加严格，传统生产模式已不能够满足白酒行业的发展需求。改变传统生产工艺，加快提升机械自动化水平，已成为白酒行业研究和发展的重要方向。

老白干香型于2004年被正式列为中国白酒的第十一种代表香型，以衡水老白干为代表，以“醇香清雅，甘冽丰柔”著称[4]。传统工艺老白干原酒制酒过程均为人工操作，包括人工蒸料、加曲、地缸发酵、上甑等。根据蒸酒工序是否加入粮食同蒸又分为清蒸清烧工艺和混蒸混烧工艺。不同原酒分别储存后，经勾调成商品酒。近年来老白干香型骨干企业对传统工艺进行机械化改造，改造后的蒸料加曲、不锈钢发酵槽中发酵、蒸酒和摘酒等工艺过程均为机械化操作。由于生产工艺的不同，机械化工艺原酒与传统工艺原酒的香气和口感尚有一定差距，其内在原因是两类工艺原酒的挥发性成分的种类和含量存在差异。

关于老白干白酒的研究主要包括用GC-O 对原酒关键香成分进行嗅闻分析[5]，用固相微萃取分析老白干挥发性成分[6-7]，用内标法对包括老白干在内的白酒中首次发现的乳酸丙酯进行定量[8]，研究发酵主要风味物质变化规律[9]以及采用HSSPME-GCMS 法建立老白干白酒风味物质指纹图谱[10]等。目前已在衡水老白干中发现166 种挥发性化合物。尚未有文献对传统工艺与现代工艺生产的老白干原酒挥发性成分进行分析比较。

全二维气相色谱（GC×GC）是20 世纪90年代初由Liu 等[11]提出的新型分离系统。相比传统一维气相色谱 （1D GC），GC×GC 具有峰容量大、结构色谱行为明显、 分离速度快和灵敏度高等优点[12]。全二维气相色谱-质谱技术（GC×GC/TOFMS）在食品分析领域得到广泛的应用，主要用于葡萄酒[13]、白酒[14]、牛肉香精[15]、鸡肉[16]风味分析等方面。目前，应用GC×GC/TOFMS 分析白酒主要有茅台[14]、泸州老窖[17]、古井贡酒[18]及清香型白酒[19]等。大多数的定性方式为谱库检索[14，17-19]结构色谱图比对[14]及保留指数比对[14]，很少使用标准品比对定性。使用GC×GC 分析比较多种样品之间化合物差异的研究已在多个文献中报道[13，20-21]，它们通常采用统计比较与计算Fisher 比率（F 值）的方法。这种方法尚未应用在白酒风味分析方面。

本文选取SPME 为样品前处理方法，使用GC×GC/TOFMS 分析老白干原酒中的挥发性成分，采用保留指数及标准品比对定性。通过统计比较与F 值分析10 种老白干原酒中挥发性成分的差异，寻找传统工艺原酒和机械化工艺原酒间的区别，为后续研究不同挥发性成分对传统工艺与机械化工艺老白干原酒风味的贡献打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

10 种老白干原酒，均来自河北衡水老白干酿酒（集团）有限公司。编号L1-L7 为不同传统工艺原酒，其中L1-L3 为3 种清蒸清烧工艺原酒，L4-L6 为3 种混蒸混烧工艺原酒，L7 为烧酒（最后一次蒸酒得到的原酒），L8-L10 为3 种机械化清蒸清烧工艺原酒，其中L8 为机械化烧酒，L9 与L10为不同生产日期的机械化普通酒。

氯化钠（NaCl），分析纯，国药集团化学试剂有限公司。C6-C20 正构烷烃，百灵威科技有限公司。

1.2 仪器与设备

GC×GC/TOFMS 系统，包括Agilent 7890B 气相 色 谱 仪 （Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA），配置第二柱温箱 （适应第二维色谱柱的温度变化）、 四喷口液氮型调制器及Pegasus 4D 飞行时间质谱仪 （LECO Corp.，St.Joseph，MI，USA）。

75μm PDMS/DVB 萃取头，固相微萃取手动进样器（美国Supelco 公司）。

1.3 试验条件

1.3.1 SPME 萃取条件 参照课题组前期工作[22]，采用75μm PDMS/DVB 萃取头萃取各种老白干原酒中的挥发性成分。所有样品均预先采用超纯水稀释至酒精度10%（V/V），取8 mL 稀释样品放入15 mL 顶空样品瓶中。加入NaCl 至饱和。在45 ℃恒温水浴中平衡20 min，插入已经在250 ℃下老化10 min 的SPME 萃取头，在45 ℃萃取40 min。萃取结束后，将萃取头在GC×GC 进样口热解析5 min，进行GC×GC/TOFMS 分析。每个样品重复进样3 次。

1.3.2 色谱条件 GC×GC 色谱系统：第一维柱：DB-WAX（30 m × 0.25 mm，0.25 μm）；第二维柱：DB-5（1.64m × 0.1mm，0.1 μm），均购于安捷伦公司，两根色谱柱通过毛细管柱连接器以串联方式连接。载气：He，纯度99.999%，流速1 mL/min；进样口温度250 ℃；压力30 psi；不分流手动进样；主柱温箱升温程序：初始温度40 ℃，保持1 min，以1℃/min 升至45 ℃，以3 ℃/min 升至150 ℃，以5℃/min 升至200 ℃；第二柱温箱升温程序：高于主柱温箱5 ℃。调制器温度：高于主柱温箱15 ℃。调制周期5 ；冷吹时间700 ms，冷脉冲是干燥氮气经过液氮冷却后由调制器调制形成。

1.3.3 质谱条件 电子轰击（EI）离子源，电子能量70 eV，传输线温度250 ℃，离子源温度250 ℃，检测器电压-1 400 V，质量扫描范围35～400 amu，TOFMS 采集频率100 Hz，离子源的灯丝在535～590 s 时关闭。

1.3.4 数据分析 GC×GC/TOFMS 检测的总离子流图采用 LECO ChromaTOF version 4D 软件处理数据，并采用NIST14 谱库检索，选取匹配度在700 以上的化合物。在原酒中初步定性的化合物通过比较测定保留指数 （RI）与文献保留指数（RIL）（误差<±30）进一步定性[23]。最后对比初步定性的化合物与标准品的保留时间与质谱图进行准确定性。

2 结果与分析

2.1 10 种老白干原酒全二维总离子流图

以传统工艺生产的老白干原酒L1 为例，其挥发性成分的3D 总离子流图见图1。由图1可见，GC×GC 分离了大量的在传统一维气相色谱柱上共流出的化合物，且在第二维上拖尾很小，不同极性的一维共流出化合物在二维平面上实现了正交分离。其余9 种原酒样品的3D 总离子流图与图1大体相似，均检测出大量挥发性成分，且一维共流出物在第二维色谱柱上分离良好。

2.2 10 种老白干原酒中共有挥发性成分

图1 SPME 法提取的老白干原酒样品L1 中挥发性成分的3D 总离子流图Fig.1 The 3D image of the total ion current chromatogram of volatiles in Laobaigan base Baijiu （L1）

对10 种老白干原酒的总离子流图做NIST 谱库检索、删除柱流失、合并重复项，选取匹配度大于700 的化合物。在两类工艺原酒中共检测到了322 种化合物。其中223 种化合物经过保留指数比对进一步定性，95 种化合物经过标准品比对进行准确定性。7 种传统工艺原酒共检出305 种共有成分，3 种机械化工艺原酒共检出294 种共有成分。两类不同工艺原酒中有286 种共有成分（见表1），其中酯类107 种，醇类44 种，醛类28 种，酮类28 种，酸类2 种，含氮类5 种，含硫类6 种，呋喃类13 种，缩醛类16 种，酚类1 种，醚类6 种，酸酐类3 种，烃类27 种。说明两类老白干原酒中的挥发性成分种类总体相同。10 种样品中，每个化合物的绝对峰体积分别乘以稀释倍数后，计算峰体积平均值及含量范围（见表1）。

表1 10 种老白干原酒中共有挥发性成分Table 1 Volatile compounds in all of 10 kinds of Laobaigan base Baijiu

（续表1）

（续表1）

（续表1）

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（续表1）

（续表1）

虽然75 μm PDMS/DVB 萃取头适合萃取极性挥发性成分，但对酸类等强极性的化合物萃取效果较差。本文只检测出2 种酸类化合物：2-甲基-2-戊烯酸和乙酸。根据以往研究经验，酸类化合物是白酒中一类重要的化合物[2，22]，这可能是由于酸类化合物极性太强，挥发性较低，不容易从样品中挥发出来，从而HS-SPME 法很难萃取到酸类化合物。

2.3 10 种原酒共有挥发性成分统计比较

采用ChromaTOF version 4D 软件对传统工艺与机械化工艺老白干原酒中挥发性成分进行统计比较，当一种挥发性成分在所有10 种原酒样品中均被检测到时，可采用Fisher 比率（F 值）比较其在10 种样品中的含量差异，结果见表1。F 值是一个相对值，其越大代表样品间该化合物差异越大[13]，经过F 值比较发现，大量共有挥发性成分在10 种样品中含量存在明显差异，如F 值较大的化合物有1-丁氧基-1-乙醚、苯乙醇、糠醛等。F 值大于5 的化合物见图2。

积面峰谱色597 624±346 588 738 683±430 744 6 564 950±4 001 642 1 955 489±2 592 668 1 743 714±3090181 151 978±178 391 109 372±129 246 23 340±26 869 121 712±173 681 20 267 721±21 700 776 1 598 247±1 392 522 1 292 570±1 160 408 71 860±38 225 385 869±494 447 2 625 519±1 287 096 268 090±432 637 234 946±315 311 65 128±58 247 200 073±96 065分成性发挥 种36的出检酒原分部 2表List of 36 compounds distributed in part of 10 Laobaigan base Baijiu Table 2 化械机酒原艺工统传述描气香酒原艺工式方性定RIS L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10出检 具有果香，苹果样的香气特征，并伴有苹果酒和甜菠萝样的香气++-+++++++，RI MS++-+++++++，RI MS味香实果的梨洋或萝 菠++-+++++++，S ，RI MS 1 181++-+++++++MS味甜，有味臭性透穿烈强 呈+- -+++++++MS 1 274味香果有+具-++++++++MS，RI，S 1 329++-+++++++，S ，RI MS 1 101 味气激刺性息窒 有-- -+++++++，RI MS味气的烈强种一有 带--++++++++，RI MS味香油黄有 具-+++++++++，RI MS等香、烤果、坚油、奶肪 脂-- -+++++++，RI MS料香用食型香 奶--++++++++MS++-+++++++MS香甜萝菠有带时释，稀香葱洋和、蒜香肉的烈 浓--++++++++，S ，RI MS 1 562 香烤+焙+-+++++++MS，RI，S 936 气香样、醚醇 清++-+++++++，RI MS++-+++++++，RI MS 1 132味风橘柑的甜带，微气香木松的香芳 呈++-+++++++，RI MS++-+++++++MS RIL 未酒原1 141 1 125 1 188 1 332 1 109 784 1 330 978 1 056 1 209 1 569 955 1 251 1 166 1 278 RI艺工化械1 133 1 134 1 185 1 217 1 311 1 335 1 113 784 1 332 972 1 054 1 319 1 166 1 566 955 1 252 1 166 1 277 1 265机名物合化号序分，部出检部全酒原艺工统传酯乙酸戊基甲2-1 酯丙酸丁基甲2-2 酯戊异酸丙3酯丙酸戊4酯戊酸丁5酯己酸丙6醇戊3-7 醛丙8醛烯己基乙2-9 酮二丁，3-2 10 酮二戊，3-2 11 酮二辛，3-2 12 吩噻基3-乙13 酯乙酸）丙基硫（甲3-14 喃呋基2-乙15 醛缩基己基乙醛乙 16烯枯 17烯油品萜 18酐酸丁异 19

积面峰谱色223 578±176 899 36 826 101±24 594 752 86 008±117 099 165 794±226 833 2 055 005±3 585 312 282 549±244 059 135 281±96 461 93 732±73 527 282 286±652 702 325 388±376 176 594 852±647 429 420 100±560 103 215 334±253 570 119 699±187 735 40 629±59 541 156 027±126 737 10 275 736±8 166 739索检库：谱：MS式方性。定化械机酒原艺工统传述描气香酒原艺工式方性定L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10+++++++-++，RI MS味香的果苹和蕉+香++-++++++MS，RI，S+++++++-++，S MS香可，可香+酒+++++-+++MS，RI，S 气香等蜜萝、菠克酿、康、甜酪乳，有香果和香醚烈强 呈+++-++++++，RI MS++++++-++- MS+++++-++++MS+++++++-++MS-- -++++- -+，RI MS香蜡和香、青香、酯香果的甜有- 具+-+++-+++MS，RI气香果水的香清 呈+-++++++-+，RI MS道味果水的和温及以气香香，花香、酯糖、焦果、坚果水有 具-- -++++- - - ，RI MS香菜、蔬香 果++-+++++-+，S ，RI MS香果，水香 甜+- -++- -+++，RI MS+- -+++- -+- MS味气性激刺的快愉不有，略气香油奶 呈--++-+++++MS-- -+++-+++，RI MS数指留保算计验试物合：化；RI到得索检库 谱NIST 14，由数指留保献：文；RIL数指留保品准：标。RIS出检未。性定）2表（续RIS RIL RI名物合化号序出检部全酒原艺工化械，机出检未酒原艺工统传分部1 105 1 094 酯乙酸烯丁3-20 1 115 1 126 1 115 酯丁基2-甲酸乙21 1 245 1 251酯乙酸丁异基羟α-22 1 317 1 331 1 326 醇-1-戊基3-甲23 1 113 1 120 酮庚4-24 1 050醇乙基硝2-25 1 482炔丙基-1-苯1-26 1 578酐酸丁 27失缺分部均中酒原艺工类两1 194 1 191 酯戊异酸丁异 28 1 276酯 1 277 丁基2-甲酸丁基2-甲29 1 301 1 300 酯乙酸烯己3-30 1 534 1 531 酯糠酸乙 31 1 146 1 158 1 161 醇烯-3-戊1-32 1 240 1 247 醇-1-烯丁基-3-甲3-33 1 389醇烯-1-壬2-34 1 131酮二己，4-3 35 1 264 1 258 烯四辛环 36中品样此在物合化：该。-出检中品样此在物合化：该：+注对比图谱质及间时留保品准：标；S性定数指留：保；RI性定

图2 F 值大于5 的化合物Fig.2 Volatiles which shown Fisher Ratio bigger than 5

2.4 10 种老白干原酒中非共有挥发性成分

有36 种挥发性成分只在部分原酒中检出，其在10 种原酒中的分布情况及香气描述详见表2。表中No.1～No.19 在传统工艺原酒中全部检出，在部分机械化工艺原酒中未检出。No.20～No.27 在部分传统工艺原酒中未检出，在机械化工艺原酒中全部检出。No.28～No.36 在两类工艺原酒中均有部分缺失。有28 个挥发性成分在部分或全部机械化原酒中未检出。其中丙醛和2，3-戊二酮只在传统工艺原酒中被检测到（L1-L7）。2，3-戊二酮，具有脂肪、奶油、坚果、烤香、焦糖香气等，其天然存在于啤酒、朗姆酒、威士忌及葡萄酒中[24]。2-乙基己烯醛、2，3-辛二酮及3-（甲硫基）丙酸乙酯这3 种在传统工艺中检测到的化合物并未在L9 与L10这两种机械化普通酒中发现。3-（甲硫基）丙酸乙酯经过标准品准确定性，其具有浓烈的肉香、蒜和洋葱香，稀释时带有菠萝甜香。本课题组曾在扳倒井芝麻香型白酒中检测到3-（甲硫基）丙酸乙酯[25]。其它在部分机械化原酒中缺少的化合物有2-甲基戊酸乙酯、2-甲基丁酸丙酯、 丙酸异戊酯、3-戊醇、2-乙基呋喃、乙醛乙基己基缩醛、枯烯、萜品油烯（除L8）、丙酸己酯（除L9）和双乙酰（除L10）。多个具有香气活性的挥发性成分在传统工艺或机械化工艺原酒中未检测到，证明两类工艺生产的原酒在挥发性成分种类方面有一定差异。

3 结论

首次应用顶空固相微萃取结合全二维气相色谱/飞行时间质谱对传统工艺与机械化工艺老白干原酒中的挥发性成分进行比较分析。7 种传统工艺原酒共检出305 种共有成分，3 种机械化工艺原酒中共检出294 种共有成分。两类原酒中共检测到322 种化合物，其中286 种化合物在10 种样品中共有，说明老白干原酒中的挥发性成分的种类相对稳定。另外，有28 个挥发性成分在部分或全部机械化原酒中未检出，其中丙醛和2，3-戊二酮只在传统工艺原酒中检出，说明传统工艺原酒与机械化工艺原酒中挥发性成分的种类存在一定差异。经过F 值比较发现大量在10 种样品中共有的挥发性成分的含量也有明显差异。表明传统工艺和机械化工艺生产的老白干原酒挥发性成分的种类大体相同，含量存在一定差异。