甲鱼嗜水气单胞菌的分离鉴定及体外抑菌试验

康绍珠 黄志琴 刘小兰 林 敏 李雅婷 曹 刚 陈林文 梁诗毅 陈飞虎 朱芝秀

江西农业大学动物科技学院，南昌 330045

甲鱼因蛋白质、维生素E含量高，具有抗氧化、降低胆固醇、抑制肿瘤等药用价值，备受广大群众的喜爱，是餐桌上常见的滋补佳肴。甲鱼生活能力及抗病力较强，自然情况下很少发病，但随着养殖业的迅速发展，甲鱼发病屡见不鲜，报道最多的是嗜水气单胞菌[1-3]。嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）隶属于弧菌科（Vibrionaceae）气单胞菌属（Aeromonas），它是一种典型的“人-畜-鱼”共患病病原菌[4]，可引起各种动物包括鱼类[5-6]、甲壳动物[7]、禽类、哺乳动物等感染发病，导致水生动物赤皮病、腹水病、败血症、穿孔病等[1-3]。6月中旬，南昌市某养殖场甲鱼大量发病，精神萎靡，行动迟缓，无食欲，背甲部出现明显疖疮，重者溃烂成洞，洞内充满白色脓状物，底板和腿部出现多处不同程度的出血斑，后期脖子丧失收缩能力（图1～图2）。对具有典型病灶的甲鱼进行细菌分离鉴定、药敏试验、体外抑菌试验，以期为临床上防控该病提供科学的理论依据。

图1 底板和腿部出血斑

图2 背甲部出现明显疖疮

1 材料与方法

1.1 病料及试验动物

南昌地区某养殖场送检甲鱼（200 g左右）；试验小白鼠:购自南昌大学医学院动物试验中心（18～20 g/只）。

1.2 主要培养基及试剂

普通平板、普通肉汤（LB）、血平板、脱脂奶平板:均由实验室自行制备；21种微量生化管试剂:杭州天和微生物试剂厂；14种药敏纸片:杭州滨和微生物试剂有限公司；pcr premix Taq:宝日医生物技术（北京）有限公司。

1.3 主要仪器及设备

COCI光学显微镜:重庆光学仪器厂；Motic数码显微镜:麦克迪奥实业集团有限公司；电热恒温培养箱:上海跃进科学仪器厂；LDZX-40BI立式自动电热压力蒸汽灭菌锅:上海申安医疗器械厂；PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、灌胶膜具及Versa Doc 100、凝胶成像系统:Bio-Rad公司；WP750微波炉:广东格兰仕公司。

1.4 病原菌的分离与纯化

选取发病症状明显及濒临死亡的甲鱼，在无菌操作下钩取甲鱼肝脏等处，划线接种于脱脂奶培养基，置于37℃恒温培养箱培养18～24 h，观察菌落培养特性。选取优势溶蛋白的典型单个菌落，划线接种普通平板，将纯化的分离菌转管普通斜面，37℃培养18～24 h后，4℃低温培养箱短时间保存备用。

1.5 病原菌的鉴定

1）培养特性及形态学观察。将分离菌划线接种普通平板和血平板，37℃培养24 h，观察菌落的培养特性，挑选单个典型菌落进行革兰氏染色镜检，观察菌体形态特征。

2）生理生化特性的鉴定。将分离菌分别接种于21种微量生化反应管，37℃恒温箱培养12～48 h，观察生长变化情况，方法按微量生化反应管说明书进行。

3）16S rRNA分子生物学上的鉴定（表1）。

1.6 药物敏感试验

采用KB纸片扩散法，进行嗜水气单胞菌对常规14种抗生素药敏试验。将分离菌接种于LB液体培养基中，37℃培养18～24 h后，均匀涂抹普通平板，待菌液吸收后用无菌镊子轻轻按贴药敏纸片，37℃培养18～24 h后用数显游标卡尺测量抑菌圈直径。根据杭州生物有限公司提供的评判标准，判断分离菌的敏感性，依次将药物敏感性分为敏感（S）、中介（I）、耐药（R）。

表1 16S rRNA分子生物学上的鉴定

1.7 乳酸菌对嗜水气单胞菌的体外抑制试验

采用牛津杯法检测乳酸菌对嗜水气单胞菌的抑制作用。将分离菌均匀涂布于普通平板上，待菌液晾干后，等距离分4个区域，将4个牛津杯轻放置于培养基上，往牛津杯中缓慢注入乳酸菌，常温静置3～5 h，于37℃培养24 h，测量抑菌圈直径。

1.8 人工感染动物试验

将25只小白鼠分成5组（试验组4组，对照组1组，5只/组）。将分离菌接种普通肉汤，37℃培养24 h后分别腹腔注射对应的4组试验组（0.5 mL/只），对照组腹腔注射同体积的0.85%生理盐水，每天观察记录试验小白鼠的变化情况。

2 结果与分析

2.1 菌落形态特征

在脱脂奶平板上，菌落形态基本一致，呈圆形，中间略隆起，边缘整齐，表面光滑，略带黄色，有透明的溶蛋白圈（图3）。在兔血琼脂平板上，菌落均呈典型透明β-溶血环（图4）。革兰氏染色后，在油镜（10×100）下为革兰氏阴性，形状大多呈短杆状，略呈弧状，两端钝圆，单个分散排列，有的常2个或几个相连（图5）。

图3 透明溶蛋白圈

图4 透明β溶血圈

图5 G染色镜检（10×100）

2.2 生理生化特性检测

分离菌均能分解甘露醇、果糖等，不分解乳糖、鼠李糖、木糖等，硝酸盐、枸橼酸盐等为阳性，H2S、尿素等为阴性，具体结果见表2。单胞菌参考序列同源性均在99.6%以上，通过MEGA6软件对提取的样本进行进化树分析可知（图7）:分离菌与嗜水气单胞菌在发育树中聚为一个分支，为嗜水气单胞菌。

表2 分离菌的生理生化结果

图6 分离菌16S rRNA的PCR扩增电泳图

图7 分离菌16S rRNA序列进化树

2.3 PCR扩增产物及16S rRNA测序结果

琼脂凝胶电泳结果显示（图6），4株分离菌扩增出大小约为1 500 bp目的片段，测序获得的基因序列通过NCBI数据库BLAST检索进行序列同源性比对，结果显示分离菌与GenBank中登录的气

2.4 药敏试验结果

由药敏试验结果可知（表3）:分离菌对林可霉素、头孢氨卞等完全耐药；对红霉素、四环素等耐药；对头孢曲松、恩诺沙星等敏感。

表3 分离菌药敏试验结果 mm

2.5 乳酸菌的体外抑制试验结果

8株乳酸杆菌（ZCR1-1～ZCR1-4，ZCR2-1～ZCR2-4）对分离菌均有显著的抑制较果（表4）。

表4 乳酸菌对分离菌的体外抑制结果 mm

2.6 动物试验结果

攻毒小白鼠经过24 h以后，呈现较高的死亡率（表5），对照组健康无病。解剖死亡小鼠可见:肝肿大、质地变硬，有明显的坏死点，颜色由红棕色变为灰色、甚至变为黑色，大面积淤血（图8～图9），将其进行细菌分离培养，得到与自然发病株一致的菌株。

表5 分离菌对小白鼠的致死情况

图8 肝脏明显的坏死点

图9 肝脏颜色变为黑色

3 讨 论

3.1 嗜水气单胞菌的鉴定

本研究根据甲鱼临床症状、分离菌的培养特性、生理生化特性等，鉴定分离菌疑似嗜水气单胞菌。本试验分离菌呈G-短杆菌，菌落光滑、边缘整齐，略带黄色，与周毅等[8]报道一致；据马子行等[9]报道，嗜水气单胞菌葡萄糖、七叶甘、精氨酸、赖氨酸、VP等试验阳性，鸟氨酸、纤维二糖等阴性，与本试验基本相符；分离株JAY-2、JAY-4靛基质阴性，与杨宁等[10]结果一致；分离株乳糖反应阴性，与石亚素等[11]试验结果相反，这可能与菌株变异有关。分离菌通过16S rRNA分子生物学鉴定及BLAST软件检索比对，确定为嗜水气单胞菌。

3.2 嗜水气单胞菌的耐药性

分离株对青霉素类、林可霉素完全耐药，与邓小红等[12]的报道一致；对第3代头孢菌素头孢曲松、阿米卡星、庆大霉素、恩诺沙星等高度敏感，与李爱华等[13]不同地区的菌株对头孢菌素类100%耐药有所差异；对诺氟沙星、卡那霉素、阿奇霉素等的敏感性表现不一，出现一定的低敏或耐药，这与王帅兵等[14]报道的阿奇霉素、诺氟沙星存在一定耐药性一致，但与苏振霞等[15]报道诺氟沙星敏感不同，这可能与用药习惯及菌株差异有关。此外，有很多学者研究表明，嗜水气单胞菌耐药率逐渐上升，甚至出现多重耐药性，如王小亮等[16]报道，A.hydrophila对动物专用广谱抗生素氟苯尼考呈现较高的耐药率和耐药浓度；宋铁英等[17]发现A.hydrophila对链霉素、氟哌酸等多种抗菌素耐药。因此，在养殖过程中，应做好养殖记录，尽量使用窄谱抗生素，联合用药和轮换用药相结合。

3.3 嗜水气单胞菌的毒力

分离株攻毒鼠于24 h内均死亡，具有较强毒力。分离株均能产生蛋白酶和溶血素，形成透明的溶蛋白圈和β溶血圈，这与牛志伟等[18]报道的嗜水气单胞菌的毒力因子蛋白酶、气溶素、血溶素等相符合。

3.4 嗜水气单胞菌的危害和防治

嗜水气单胞菌为条件致病菌，分致病菌和非致病菌，在养殖环境恶劣、机体免疫低下、应激等条件下常感染动物发病，是水产养殖业危害最严重的病原菌之一，常引起水产动物的暴发性死亡，在4-11月均可暴发，一旦暴发，治疗十分困难。因此，有效防控嗜水气单胞菌病尤为重要。

本试验通过乳酸菌的体外抑制试验可知，乳酸菌对嗜水气单胞菌有较强的抑制作用，这与任鹏飞[19]报道的乳酸菌对嗜水气单胞菌有较强的抑制作用相一致，并且其研究发现乳酸菌发酵液的抑菌作用强于菌体；朱芝秀等[20]报道，益生菌对嗜水气单胞菌的抑制作用与其浓度有关，浓度越大，抑菌作用越强。可见，乳酸菌等益生菌是防治嗜水气单胞菌的良好的导向。此外，诃子、黄连、五倍子等中草药[21]对嗜水气单胞菌具有较好抑菌作用。因此，生物制剂和中草药的使用，不仅能减少耐药株的产生，还能有效防控嗜水气单胞菌。