产黄酮番木瓜内生真菌的筛选和鉴定

柯树炜 吕金慧 陈萍 张荣萍 俞悦

（海南大学热带农林学院，海口 570228）

植物内生真菌是一类定殖于宿主植物体内的特殊微生物类群。自1993年Stierle等［1］从红豆杉中分离得到了一株产紫杉醇的红豆杉内生真菌安德鲁紫杉菌（Taxomyces andrena）后，关于利用植物内生真菌来获得天然活性物质的研究就成为了近年来的热点。研究表明植物内生真菌的代谢产物中天然活性成分非常丰富，不仅能产生与宿主植物相同或相似的活性物质，还能够通过自身的代谢体系产生新的活性成分，已知结构和结构新颖的化合物均有报道［2］。番木瓜是著名的热带、亚热带果树之一。含有生物碱、萜类化合物、黄酮类化合物等多种生物活性成分，研究表明其具有良好的生物活性［3-4］。但国内外对番木瓜内生真菌的研究仍然较少，本次实验从番木瓜植株的茎、叶、果等各部位分离内生真菌。通过对其菌株的次生代谢产物成分进行初步分析，筛选其中具有产黄酮类物质功能的菌株，并通过观察PDA平板上菌落和分生孢子的形态以及内转录间隔区（Internal transcribed spacer，ITS）序列分析等手段对菌种进行了鉴定。本研究将为开发植物内生真菌这一微生物资源和利用发酵法生产黄酮类物质提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品与试剂 番木瓜采样地点位于海南大学海甸校区农科基地，随机采集不同番木瓜植株的叶片、枝条、果实。甲醇、乙醇、NaClO、乙酸乙酯、NaOH、FeCl3、硼酸、Al（NO3）3、NaNO2等均为分析纯级试剂。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）用于分离和纯化，马铃薯葡萄糖肉汤培养基（PDB）用于菌株摇瓶发酵。

1.2 方法

1.2.1 内生真菌的分离 番木瓜植株各部位内生真菌的分离采用常规的植物内生菌组织分离法［5］。略作修改后具体做法如下：将从番木瓜植株上采集带回的无明显病斑叶片、枝条、果实用流水冲洗。用无菌刀片将上述番木瓜植株样品切分成适当大小的组织块，首先用75%乙醇处理组织块75 s、之后用2.6% NaClO溶液浸泡处理组织块150 s，最后用无菌水冲洗3-5次进行表面消毒。将处理好后的样品用无菌刀片除去暴露在外界环境中的表皮部分，切成0.5 cm × 0.5 cm组织块。移入PDA培养基（含氯霉素）进行培养，每个培养皿中呈品字形放置3个组织块。28℃培养5-7 d，观察并记录组织块的出菌状况，及时转移并纯化菌株。

1.2.2 菌株发酵与供试样品的制备 选取于PDA平板上长势良好且单一的菌株，利用直径大小约为6 mm的打孔器在平板上打孔，将3-5个菌饼接种于灭菌冷却后的PDB肉汤中。500 mL锥形瓶中加入250 mL PDB肉汤，封口膜扎紧，在振荡培养箱内设置温度28℃、转速130 r/min摇瓶发酵10 d。菌株发酵10 d之后，真空抽滤，分别得发酵液和菌丝体两部分。发酵液利用等体积乙酸乙酯萃取3次，旋转蒸发仪50℃将萃取液回收浓缩至原体积的1/10。过滤所得菌丝体在鼓风干燥箱内55℃烘干后研磨成粉，菌丝体和乙酸乙酯质量体积比（W/V）为1：20料液比萃取，超声处理1 h，过滤除去不溶物，减压回收浓缩。将上述发酵液和菌丝体两部分的浓缩萃取液合并，50℃旋转蒸发至干，即得菌株的次生代谢产物，4℃保存备用。

1.2.3 样品的显色反应检测［6-7］硝酸铝-亚硝酸钠反应检测：将样品液定点滴加于滤纸上，稍干之后反复滴加3次，浓缩样品。将10%Al（NO3）3（W/V）溶液和NaNO2（W/V）溶液1：1混合滴加于样品位置。挥干后滤纸片立即于紫外灯下检视，观察是否有荧光斑点或荧光环出现。

氢氧化钠溶液反应检测：将1.0 mL样品液置于试管中，加入4%（W/V）的NaOH溶液0.2 mL，观察是否有黄色或黄褐色现象出现。

乙酸镁甲醇溶液反应检测：将 1.0 mL样品液置于试管中，加入1%（W/V）的乙酸镁甲醇溶液0.25 mL，观察是否有黄色出现。

三氯化铁溶液检测：1.0 mL样品液置于试管中，加入0.25 mL质量分数为1%（W/V）的FeCl3溶液，充分混合，观察是否有墨绿色至紫黑色现象出现。

硼酸反应：将1.0 mL样品液置于试管中，加入2%（W/V）的硼酸溶液0.25 mL，观察溶液是否有黄色出现。

1.2.4 薄层色谱法（TLC）以氯仿∶甲醇∶甲酸=15∶5∶1（V/V）为展开剂，在距离硅胶板一端0.4 cm处用铅笔划线，作为点样起始线的标记。用毛细管将显色反应筛选所得阳性样品点于硅胶板展开，以0.5 mg/mL槲皮素标准品作为对照。当溶剂前沿达到硅胶板另一端0.2-0.3 cm时取出。使用3%（W/V）AlCl3甲醇溶液作为显色剂，硅胶板取出挥干后喷雾显色，365 nm紫外灯检查和记录。

1.2.5 紫外吸收光谱检测 以甲醇溶液为空白对照，将次生代谢产物样品用甲醇定容并稀释至适宜浓度，在220-420 nm之间进行光谱扫描，寻找样品溶液最大吸收峰所在波长。检测其是否符合黄酮类化合物在甲醇溶液中的UV光谱特征［8］。

1.2.6 总黄酮含量的测定［9］菌株次生代谢产物中总黄酮含量的测量参照硝酸铝显色法，具体做法如下：分别吸取 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL芦丁溶液1.0 mL至于10 mL试管中，加入5%NaNO2（W/V）溶液0.4 mL混匀，放置6 min；加入Al（NO3）3（W/V）溶液 0.4 mL，放置 6 min；加入 4%（W/V）NaOH溶液4.0 mL，充分混合后用甲醇定容至10 mL，静置反应15 min；在510 nm处测定吸光值并建立标准曲线。将发酵所得次生代谢产物配置为1 mg/mL的甲醇溶液作为供试样品液。根据标准曲线计算样品中总黄酮含量。

1.2.7 菌株鉴定 通过菌株的形态学特征和ITS序列分析，对经显色反应筛选、TLC分析和UV分析后初步确定产黄酮类物质的内生真菌进行鉴定。内生真菌菌株形态特征的观察通过插片法［10］进行制片，并利用棉蓝染色液进行染色，在Leica生物显微镜DM2000下放大400倍和1 000倍检视菌株分生孢子梗和分生孢子的形态特征。ITS序列分析利用试剂盒D2300提取菌株总DNA，并选用ITS1F正向（5'-CTTGGTCATTTAGAGAAGTAA-3'）和 ITS4反向（5'-TCCTCCGCTTAGATATGC-3'）作为扩增引物。

PCR采用25.0 μL反应体系，具体如下：2 ×PCR MasterMix 12.5 μL，10 μmol/L 的正反引物各 1.0 μL，内生真菌菌株模板 DNA 1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸50 s，总计30个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物送广州华大基因服务有限公司进行测序。测序所得内生真菌的ITS序列通过BLAST程序在NCBI数据库中进行相似性序列检索比对，若序列相似性大于99%，可鉴定为相同种；介于95%-99%之间，可鉴定为相同属；小于95%，可鉴定为相同科［11］，以此获得菌株分子鉴定结果。通过MEGA7.0软件［12］，以邻接法（Neighbor joining method）构建系统发育树，其中bootstrap设置检验值≥50%，共1 000次重复。

2 结果

2.1 显色反应初筛选

由于硝酸铝-亚硝酸钠反应是黄酮类物质的特异显色剂，可以使黄酮类物质在紫外灯下显荧光，而其他显色剂可能因为阳性反应颜色变化较弱或样品本身颜色较深不易观察，因此本次实验中利用显色反应筛选产黄酮菌株的必要条件是硝酸铝-亚硝酸钠滤纸显色反应为阳性。经过显色反应的初步分析，在分离所得的内生真菌中，菌株编号为G41的样品液对下表中所述5种显色反应均显阳性。初步判断菌株G41可产黄酮类物质（表1）。

表1 显色反应结果

2.2 薄层层析结果分析

对初筛选得到的阳性菌株进行薄层层析，样品在硅胶板上展开并显色后。菌株G41的乙酸乙酯提取物显示出与对照所用槲皮素具有相同Rf值的黄绿色荧光斑点。说明其菌株的次生代谢产物中含有与槲皮素相同或相似的黄酮类化合物。其他菌株的乙酸乙酯提取物在展开显色后虽然同样能呈现黄绿色荧光斑点，但是与本次实验中所用对照迁移率不符，可能含有的是与槲皮素不同的其他黄酮类的物质（图 1）。

图1 内生真菌G41薄层层析图

2.3 紫外光谱扫描结果分析

根据220-420 nm之间紫外光谱扫描的图谱显示，菌株G41的乙酸乙酯提取物在波长220-420 nm间有2个较明显的吸收峰，最大吸收峰分别在317 nm、254 nm处，这与黄酮类化合物的甲醇溶液普遍在200-400 nm间存在2个主要吸收峰带分别是300-400 nm峰带I和220-280峰带II的UV光谱特征相符合（图2）。进一步说明该菌株G41的乙酸乙酯提取物中存在黄酮类成分。

图2 菌株G41乙酸乙酯提取物在220-420 nm处的紫外光谱图

2.4 总黄酮含量测定结果

如图3所示，以芦丁为对照品所测回归方程为y= 1.045 7x+ 0.004 6，R2= 0.997 6，回归方程表明其在0.1-1.0 mg之间的线性关系良好，经换算被测样品菌株G41浓度为1 mg/mL的乙酸乙酯提取物中总黄酮类物质含量为0.187 8 mg/mL。

图3 总黄酮标准曲线图

2.5 菌株G41的形态与分子鉴定

番木瓜内生真菌G41在PDA培养基上28℃培养3 d后，平板划线处分生孢子结构大量产生，菌落正面呈现绿色或近灰绿色。菌丝有隔，分生孢子梗各顶端的小梗以扫帚状的形式分支，产生球形或椭圆形的大量分生孢子。根据真菌鉴定手册［13］进行比对，该内生真菌菌株G41符合其中关于青霉属菌株的形态特征描述。

该菌株测序所得ITS序列在NCBI上通过BLAST程序进行比对，下载其中相似度最高的菌株序列以及相关种属菌株的ITS序列数据并保存，利用MEGA7.0软件构建系统发育树。结果如图4所示。基于14个菌株的ITS序列构建的系统发育树中，菌株G41与Penicillium citrinumMG659617.1和P.citrinumMH483870.1两株橘青霉菌株聚在同一个分支（图5）。通过ITS序列分析结合菌落和分生孢子形态特征，初步鉴定该内生真菌G41为青霉属橘青霉P. citrinum。

图4 内生真菌G41的平板菌落形态及其分生孢子形态（放

3 讨论

图5 基于 rDNA ITS 序列采用邻接法构建的番木瓜内生真菌G41与相关种属菌株的系统发育树

近年来，针对植物内生真菌及其代谢产物的研究日益增多，特别是关于活性成分生产菌的筛选以及活性物质的化学成分分析等方面［14］。其中，能够产黄酮类物质的内生真菌在多种不同宿主植物的内生真菌中均有报道，并且发现该部分内生真菌多分布于镰胞霉属（Fusarium）、曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillin）、交链孢属（Alternaria）等多个种属中［15-16］。周宁等［17］从甘蔗叶内生真菌中利用化学显色反应、薄层层析法和紫外吸收光谱法筛选出3株鉴定为棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）和黑曲霉（Aspergillus niger）的产黄酮内生真菌。范瑛阁等［18］利用化学显色法和薄层层析法从罗布麻叶中筛选出可产黄酮类物质的镰孢菌（Fusariumsp.）和嗜松青霉（Penicillin pinophilum）。张海龙等［19］利用黄酮类物质显色反应、薄层层析法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）从银杏根部位筛选出卷枝毛霉（Mucor circinelloides）和尖镰孢菌（Fusarium oxysporum）2株产黄酮类物质的内生真菌。

本研究选择番木瓜为寄主植物作为试验材料，筛选获得1株产黄酮的内生真菌并鉴定为橘青霉，与在其他寄主植物上已发现的具有产黄酮类物质功能的内生真菌有所不同。其所产黄酮类物质与番木瓜是否具有内在联系有待进一步探究。本研究还发现了番木瓜其他内生真菌对其中一种或数种显色测试也有微弱的阳性反应结果，有可能是其内生真菌菌株液体发酵后，得到的黄酮类物质产量较低或次生代谢产物中成分复杂从而影响了显色结果，这也会导致部分产黄酮菌株漏筛。因此下一步研究需要通过高效液相色谱法、毛细管电泳法等更多检测手段鉴别内生真菌中次生代谢产物的成分［20］，并通过微生物诱变育种［21］、培养基配方改良、发酵条件优化［22］等手段，提高内生真菌在宿主植物体外培养时产黄酮类物质的能力和稳定性。

4 结论

本研究利用显色反应、TLC和UV法对番木瓜内生真菌次生代谢产物中是否含有黄酮类物质进行了鉴别，筛选得到了1株产黄酮类物质成分的内生真菌。并通过硝酸铝显色法测定了其菌丝体和发酵液的乙酸乙酯提取物中的总黄酮含量为0.187 8 mg/mL，表明其具有进一步开发利用的潜在价值。同时提取了该内生真菌总DNA，利用扩增的ITS序列进行菌株的分子鉴定，并结合PDA平板上的菌落形态特征和显微镜下产孢结构，鉴定该内生真菌菌株G41为橘青霉（P. citrinum）。本研究扩展了筛选产黄酮内生真菌的寄主植物范围，为利用番木瓜内生真菌开发黄酮类活性成分提供了新的资源。