血小板膜糖蛋白Ⅱb、Ⅲa基因多态性与急性缺血性脑卒中的关系研究

山媛，崔小丽，蒋锋，梁导艳，孙晶莹

急性缺血性脑卒中（acute ischemic stroke，AIS）是临床最常见的脑血管疾病，约占脑血管疾病患者总数的70%。据统计，我国每年有150～200万例新发卒中患者，这给患者及其家属造成严重的经济及心理负担［1］。AIS发病原因复杂，存在个体差异，且与环境、遗传等多种因素有关。血小板膜糖蛋白（platelet glycoprotein，GP）Ⅱb/Ⅲa受体与纤维蛋白原有效结合是血小板聚集、血栓形成的最后通路，且在血栓形成过程中发挥着至关重要的作用。PAC-1为GPⅡb/Ⅲa纤维蛋白原受体，是目前公认的可反映早期血小板活化程度的特异性标志物。近年来，从分子生物学角度研究GP基因多态性与AIS的关系并探讨脑卒中的发病机制已成为该领域的研究热点。本研究旨在分析GPⅡb、Ⅲa基因多态性与AIS的关系，以初步探讨AIS的发病机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2017年10月—2018年11月陕西省人民医院神经内一科收治的AIS患者110例作为病例组，均符合《各类脑血管疾病诊断要点》［2］中AIS的诊断标准，并经颅脑磁共振成像（MRI）检查确诊。纳入标准：（1）发病至入院时间≤7 d；（2）首次发病且未服用抗栓、抗凝药物（如阿司匹林、氯吡格雷、双嘧达莫、华法林等）或既往脑梗死近2周停用抗栓、抗凝药物。排除标准：（1）合并出血性脑血管疾病、短暂性脑缺血发作（TIA）、颅内占位性病变、颅内感染者；（2）伴有严重心、肝、肾功能不全者；（3）合并血液系统疾病、严重自身免疫系统疾病者；（4）临床资料不完整；（5）患者或其家属依从性差、不能完全配合研究者。另选取同期在陕西省人民医院门诊体检中心的体检健康者90例作为对照组。本研究经陕西省人民医院医学伦理委员会审核批准，所有受试者知情并签署知情同意书。

1.2 观察指标 比较两组受试者一般资料、实验室检查指标及GPⅡb、Ⅲa基因型和等位基因分布频率，不同GPⅡb、Ⅲa基因型患者PAC-1阳性血小板百分比。

1.2.1 一般资料 收集两组受试者一般资料，包括性别、年龄及吸烟、饮酒情况。

1.2.2 实验室检查指标 病例组患者于服用抗栓、抗凝药物前采集肘静脉血2 ml，对照组受试者于体检当天抽取肘静脉血2 ml，均于0.5 h内送检。采用荧光素标记的单克隆抗体流式细胞术检测细胞抗原表达、细胞大小及细胞内颗粒，识别正常细胞和异常细胞，计数PAC-1阳性血小板百分比，其参考范围为0～10%。单克隆抗体及其配套试剂均购自美国BD公司，所用仪器为Beckman Coulter FC500流式细胞仪。采用氧化酶法检测两组受试者总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、空腹血糖（FPG）及同型半胱氨酸（Hcy）水平，所用仪器为美国贝克曼AU 5800全自动生化分析仪。

1.2.3 聚合酶链式反应（PCR） 抽取两组受试者肘静脉血400 μl，采用全血基因组DNA提取试剂盒〔天跟生化科技（北京）有限公司生产〕提取DNA，使用紫外分光光度计测定DNA浓度，并置于-80 ℃冰箱中保存备用。GPⅡb基因引物参照文献［3］，GPⅢa基因引物参照文献［4］，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，采用ABI 2720 PCR仪进行扩增反应。GPⅡb基因上游引物序列：5'-CTCAAGGTAAGA GCTGGGTGGAAGAAAGAC-3'，下游引物序列：5'-CT CACTACGAGAACGGGATCCTGAAGCCTC-3'，扩增目的片段长度253 bp，PCR扩增反应体系：MIX 20 μl，上、下游引物各 1 μl，DNA 2 μl，水 16 μl，共 40 μl；反应条件：95 ℃预变性 5 min，95 ℃变性 30 s，60.5 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共 40 个循环，最后 72 ℃延伸10 min。GPⅢa基因上游引物序列：5'-GTCGCCATAGC TCTGATTGC-3'，下游引物序列：5'-GAGCCGGAGTG CAATCCTCT-3'，扩增目的片段长度239 bp，PCR扩增反应体系：MIX 20 μl，上、下游引物各 1 μl，DNA 2 μl，水 16 μl，共 40 μl；反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性 30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共40个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR扩增反应完成后取10 μl产物行2%琼脂糖凝胶电泳，确认目的片段大小。marker条带从上往下依次是1 000、700、500、400、300、200、100，左侧为GPⅢa基因扩增目的片段，右侧为GPⅡb基因扩增目的片段，见图1。1.2.4 单核苷酸多态位点（SNP）测序 将PCR扩增产物直接送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，分析GPⅡb、Ⅲa基因多态性，测序方法为3730鸟枪法一代测序。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理，计量资料以（x± s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验，两组间比较采用两独立样本t检验；计数资料分析采用χ2检验；采用Hardy-Weinberg平衡定律检验基因型分布情况。以P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 GPⅡb、Ⅲa基因扩增目的片段Figure 1 Amplified target fragments of GP Ⅱ b，Ⅲ a genes

图2 GPⅡb基因SNP测序结果Figure 2 SNP sequencing results of GP Ⅱ b gene

2 结果

2.1 一般资料和实验室检查指标 两组受试者男性比例、年龄、吸烟率、饮酒率及TG比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；病例组患者PAC-1阳性血小板百分比、TC、FPG、Hcy高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

2.2 SNP测序 SNP测序结果显示，GPⅡb基因第18809位胸腺嘧啶（T）被鸟嘌呤（G）取代，使编码第843位点的异亮氨酸（Ile）被丝氨酸（Ser）取代，形成Ile843Ser多态性，见图2。GPⅢa基因第1565位T被胞嘧啶（C）取代，使编码第33位点的亮氨酸（Leu）被脯氨酸（Pro）取代，形成Leu33Pro多态性，见图3。

2.3 GPⅡb、Ⅲa基因型和等位基因分布频率 病例组与对照组受试者基因型分布频率均符合Hardy-Weinberg平衡定律（χ2值分别为0.60、2.38，P值分别为0.75、0.31）。两组受试者GPⅡb基因型和等位基因分布频率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中病例组患者ab基因型、bb基因型及b等位基因分布频率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。两组受试者均未检测出CC基因型，GPⅢa基因型和等位基因分布频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表3）。

2.4 不同GPⅡb基因型患者PAC-1阳性血小板百分比比较 aa基因型患者PAC-1阳性血小板百分比为（6.38±3.02）%，ab基因型为（7.65±4.96）%，bb基因型为（9.08±3.27）%。不同GPⅡb基因型患者PAC-1阳性血小板百分比比较，差异有统计学意义（F=3.297，P=0.041）；其中bb基因型患者PAC-1阳性血小板百分比高于aa基因型，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 两组受试者一般资料和实验室检查指标比较Table 1 Comparison of general information and laboratory examination results between the two groups

2.5 不同GPⅢa基因型患者PAC-1阳性血小板百分比比较 TT基因型患者PAC-1阳性血小板百分比为（7.61±4.22）%，TC基因型为（7.33±1.23）%。不同GPⅢa基因型患者PAC-1阳性血小板百分比比较，差异无统计学意义（t=0.134，P=0.893）。

图3 GPⅢa基因SNP测序结果Figure 3 SNP sequencing results of GP Ⅲ a gene

表2 两组受试者GPⅡb基因型和等位基因分布频率比较〔n（%）〕Table 2 Comparison of genotype and allele distribution frequency of GP Ⅱ b between the two groups

表3 两组受试者GPⅢa基因型和等位基因分布频率比较〔n（%）〕Table 3 Comparison of genotype and allele distribution frequency of GP Ⅲ a between the two groups

3 讨论

AIS具有发病率高、复发率高及致残率高等特点，已成为严重威胁全球范围内居民健康的主要疾病之一［5-6］。既往研究表明，遗传相关因素可能增加人群卒中易感性，成为卒中发生的重要原因之一［7-8］。动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是缺血性脑卒中的重要病理基础［9］，血管内皮细胞损伤及功能障碍贯穿AS发生及发展的整个过程，暴露的胶原和组织因子促进GP与胶原结合，进而引起血小板黏附与活化，释放二磷酸腺苷（ADP）和血栓素A2（TXA2）等活性物质，促使GPⅡb/Ⅲa表达增加、三级结构变化及受体结合位点暴露，最终导致血小板聚集及血栓形成。

既往研究表明，GP在血小板黏附、聚集和活化过程中发挥着重要作用［10］。目前已确认的GP基因主要包括GPⅢa基因和GPⅡb基因，二者均定位于染色体17q21-q22，GPⅡb基因位于GPⅢa基因的3'端。GPⅡb基因包含30个外显子和29个内含子，全长约17.2 kb。GPⅢa基因包括14个外显子和13个内含子，基因全长约46 kb。GPⅡb和GPⅢa基因在血小板上以Ca2+依赖性二聚体形式存在，其在复合物状态下才能很好地发挥受体功能。DNA分子上携带的基因信息决定蛋白质性质，如DNA分子上特定部位的碱基名称、数量和顺序发生改变，则其所编码的蛋白质结构也会发生变化。

目前，GPⅡb基因多态性的研究报道较少，研究较为深入的是HPA3a/3b，即2622T→G突变导致异亮氨酸（HPA-3a）被丝氨酸（HPA-3b）取代［11］。本研究结果显示，病例组患者ab基因型、bb基因型及b等位基因分布频率高于对照组，与既往研究结果相一致［12］，提示GPⅡb基因多态性可能与AIS发生有关。本研究结果还显示，bb基因型患者PAC-1阳性血小板百分比高于aa基因型，提示携带b等位基因可能通过增强血小板早期活化程度而增加AIS发生风险，分析其原因可能为基因突变导致GP表面纤维蛋白原受体的分布密度、形态和功能改变，血小板活化功能随之改变，从而增加血栓性疾病如心肌梗死、AIS、深静脉血栓形成等发生风险［13］。

GPⅢa基因多态性是T1565C，即2号外显子的1565T→C点突变导致第33位点处亮氨酸（HPA-la，PlA1）被脯氨酸（HPA-lb，PlA2）取代，称为PlAl/A2同种抗原系统。FLOVD等［14］研究表明，脑梗死患者PlA2等位基因和PlA2/A2基因型频率高于正常对照组，提示PlA2等位基因可能是脑梗死的独立危险因素。TODINOVA等［15］研究表明，携带PlA2等位基因可能通过调节血小板细胞膜弹性、形态及活化状态而促进血栓形成。但MAGUIRE等［16］研究却发现，GPⅢa rs5918基因多态性与缺血性脑卒中发生无关。本研究结果显示，两组受试者GPⅢa基因型和等位基因分布频率间无统计学差异，且不同GPⅢa基因型患者PAC-1阳性血小板百分比间无统计学差异，提示GPⅢa基因多态性与AIS发生无关，分析其与既往研究结果不同的原因可能如下：（1）基因发挥作用受环境等多种因素影响；（2）不同种族、人群存在遗传异质性；（3）GPⅢa基因可能与AIS其他高危等位基因位点之间存在连锁关系。

综上所述，GPⅡb基因多态性与AIS的发生有关，携带b等位基因者可能通过增强血小板活化程度而增加AIS发生风险，而GPⅢa基因多态性则与AIS的发生无关；但本研究为单中心研究，代表性有限，结果结论仍有待多中心联合、前瞻性研究进一步证实。

作者贡献：山媛进行文章的构思与设计，结果分析与解释，负责撰写论文，对文章整体负责，监督管理；山媛、崔小丽进行研究的实施与可行性分析，论文的修订；山媛、蒋锋、梁导艳、孙晶莹进行数据收集、整理、分析；蒋锋负责文章的质量控制及审校。

本文无利益冲突。