液质联用法测定饲料原料乳清粉中的喹烯酮含量

■金晓峰 焦仁刚 赵 贵 黄 鑫 栾庆祥 章厉劼 孙播东

（贵州省兽药饲料监察所，贵州贵阳 550003）

近年来，随着乳制品工业的发展以及我国养殖水平的提高，乳清粉已经成为幼畜尤其是乳猪饲料中不可缺少的原料之一[1]，具有提高幼龄仔猪的采食量和生长速度[2]、降低仔猪血清尿素氮，增强蛋白质沉积能力[3]、调节免疫力[4]等作用，广泛应用于饲料行业。

喹烯酮(Quinocetone)是中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所研制的畜禽抗菌、止泻、促生长新药，属喹噁啉类药物，为淡黄色或黄绿色粉末，不溶于水，略溶于部分有机溶剂，对光敏感，较易发生光化学反应[5]，化学结构式见图1。

图1 喹烯酮化学结构式

喹烯酮的毒性小，作为饲料添加剂，具有提高动物生产性能和饲料转化率，降低腹泻率和死亡率等功能[6]，被应用于药物饲料添加剂。但2009年有研究显示，喹烯酮具有潜在的遗传毒性，能造成遗传物质的损伤[7]。因此，有必要控制喹烯酮的使用，并建立饲料及饲料原料中喹烯酮含量的方法，以监控饲料产品质量安全情况。

目前，我国已建立了饲料中喹烯酮的检测方法[8]，但通过试验验证，不适用于乳清粉等高蛋白含量的饲料原料，无法检出其中喹烯酮含量。其他已报道的喹烯酮含量测定方法还有液相色谱法[9-11]，经试验验证，也无法检出乳清粉等高蛋白含量的饲料原料中喹烯酮含量。鉴于液相色谱串联质谱技术拥有更高的灵敏度和更好的准确性，本文研究并建立了一种采用液质联用法测定饲料原料乳清粉中喹烯酮含量的方法。

1 试验部分

1.1 主要仪器

Waters XEVO TQ-xs 高效液相色谱串联质谱联用仪（美国沃特世公司）；Milli-Q Direct-Q10 超纯水机（美国密理博公司）；SIGMA 3K15 高速冷冻离心机（德国西格玛公司）；METTIJER AB104-S电子分析天平（瑞士梅特勒公司）；Reacti-Therm Ⅲ氮吹仪（美国赛默飞公司）；IKA MINISHARKER 涡旋振荡器（德国伊卡公司）；SG5200HPT超声波清洗机（上海冠特仪器有限公司）。

1.2 主要试剂

喹烯酮对照品（中国兽医药品监察所）；Waters PRiME HLB 固相萃取柱（规格为60 mg/3 ml，美国沃特世公司）；甲醇（色谱纯，德国默克公司）；甲酸（色谱纯，德国默克公司）；二甲亚砜（分析纯，国药集团化学试剂公司）；试验用水均为Milli-Q Direct-Q10超纯水。

2 方法

2.1 标准溶液的配制

精密称取适量喹烯酮对照品于棕色容量瓶中，少量二甲亚砜溶解后，用甲醇稀释得到含喹烯酮浓度为1 000 μg/ml 的标准储备液。取适量喹烯酮储备液，用甲醇稀释得到含喹烯酮10 μg/ml 的标准中间液。为消除基质效应，本方法采用基质加标制备标准曲线，分别精密量取适量的喹烯酮标准中间液，加入到净化后的空白试样中，50 ℃下氮气吹干，1 ml甲醇-1%甲酸水溶液（10∶90）溶解，绘制浓度为20、50、100、200、500、1 000 ng/ml的标准工作曲线。

2.2 饲料原料乳清粉中喹烯酮的提取

称取饲料原料乳清粉(1.00±0.05) g 于50 ml 离心管中，加入80%乙腈（含甲酸0.2%）10 ml，涡旋提取1 min，超声提取15 min，于10 000 r/min 转速下离心5 min，收集上层提取液于另一离心管中，备用。

2.3 饲料原料乳清粉中喹烯酮的净化

将PRiME HLB 固相萃取柱安装到真空萃取装置上，取1 ml上清液过柱，收集全部滤液，备用。

2.4 测定方法

将前处理后的样品液于50 ℃下氮气流吹干，1 ml甲醇-1%甲酸水溶液（10∶90）溶解，过0.22 μm 滤膜后供高效液相色谱串联质谱联用仪测定。

已有的报道中测定方法多为液相法或液质法，液相法多采用高效系统，质谱系统多采用电喷雾离子源（+）的方式，本研究参考了相关文献[8，12]，对液质联用仪的仪器条件进行了优化。

2.4.1 色谱条件

色谱柱（型号为Waters BEH Shield RP18 ，规格为1.7 μm，2.1 mm×50 mm），柱温30 ℃，进样量为1 μl，流速为0.3 ml/min，流动相采用甲醇+0.2%甲酸水溶液（梯度方式），梯度比例见表1。

表1 高效液相色谱流动相梯度条件

2.4.2 质谱条件

离子源为电喷雾ESI+，源温为120 ℃，雾化温度为400 ℃，雾化气流流速为500 L/h，锥孔气流流速为60 L/h。

2.4.3 喹烯酮特征离子（见表2）

表2 喹烯酮特征离子

3 结果

3.1 试验谱图

经上述方法测试，标准溶液、空白试样及阳性添加试样经液相色谱串联质谱联用仪分析得到的图谱见图2～图4。

3.2 标准曲线的绘制

图2 标准溶液特征离子图谱

图3 空白试样特征离子图谱

喹烯酮对照品工作液按峰面积以外标法进行回归计算，绘制得到的标准曲线见图5，在线性范围为20～1 000 ng/ml下相关系数R2为0.999 1。

3.3 提取剂的选择

现有标准和文献报道中，喹烯酮通常使用40%乙腈[8]、100%乙腈[9]、60%乙腈[10]、甲醇-乙腈溶液（1∶1）[12]、0.5%磷酸缓冲液(pH=3.0)[13]等作为提取剂。饲料原料乳清粉蛋白质含量极高，经试验验证以上提取剂的提取效果均不理想，本研究比较了上述提取剂和甲酸酸化的80%乙腈的效果（结果见表3），最终选择甲酸酸化的80%乙腈为本方法提取液。

3.4 净化方式的选择(见表4)

图4 阳性添加样品特征离子图谱

现有标准和文献报道中，喹烯酮净化方式主要有HLB 固相萃取[8，11]、中性氧化铝固相萃取[12]，也有不经过净化，直接上机测定含量的方式[9，13]。省去净化环节可减少前处理操作，但样品基质较复杂，不利于仪器的长期使用，同时带来的基质效应也非常强，本研究选择了新一代PRiME HLB 固相萃取柱，样品提取液不经过淋洗和洗脱过程，减少前处理操作的同时，也起到了良好的净化作用。

3.5 灵敏度考察

向空白试样中添加适量喹烯酮，经上述方法测试液质联用试验谱图，观察特征离子质量色谱峰信噪比（S/N）和对应药物的浓度，S/N＞3 者为方法检测限，S/N＞10 者为方法定量限。当样品中喹烯酮含量为5 μg/kg 时，液质谱图中喹烯酮峰S/N＞3，即检测限为10 μg/kg；当样品喹烯酮含量为10 μg/kg时，液质谱图中S/N＞10，即定量限为10 μg/kg。说明当饲料原料乳清粉中喹烯酮含量高于0.5 μg/kg时即可检出，当含量高于1.0 μg/kg时即可准确定量。

图5 喹烯酮标准曲线

3.6 准确度和精密度考察

表3 提取剂回收试验结果

表4 不同净化方式回收试验结果

向空白试样中添加适量喹烯酮，制备得到喹烯酮含量分别为20、50、100、500 μg/kg 的阳性添加试样，每个浓度6 份平行试样，按上述最佳方法进行提取、净化、浓缩、测定，以实测含量与理论含量的百分比计算回收率，考察方法的准确度；同时计算相对标准偏差（RSD），以批内和批间试验结果的RSD考察方法的精密度。试验结果如表5。

由表5 可知，饲料原料乳清粉中各浓度喹烯酮含量测定回收率范围在79.9%～90.8%之间，准确度较高。

表5 饲料原料乳清粉样品准确度及精密度试验结果（n=6）

从饲料原料乳清粉中各浓度喹烯酮含量测定结果分析试验精密度，批内变异系数RSD 为1.71%～4.48%，批间变异系数RSD为5.24%，精密度较高。

4 讨论

4.1 提取剂的选择

本文研究了甲酸酸化的80%乙腈、40%乙腈、60%乙腈、甲醇-乙腈溶液（1∶1）、0.5%磷酸缓冲液、100%乙腈等提取剂的提取效果。磷酸缓冲液应不具备挥发性，不适用于液质联用法检测，未进行测试，40%乙腈、60%乙腈加入到饲料原料乳清粉中，因样品溶解到提取液中，改变了极性，形成明显的分层现象，经试验测试，上下两层均有喹烯酮，但浓度比例没有规律，未采用该两种提取液；其余三种提取液经试验比较，甲酸酸化的80%乙腈提取效率较好，最终确定为提取剂。

4.2 选择净化方式

比较了HLB固相萃取和PRiME HLB固相萃取柱的净化效果，均达到预期要求，因PRiME HLB方法简化了前处理过程，净化时间由40 min缩短至5 min，故本文选择了PRiME HLB 的净化方式，取得的效果较为满意。

4.3 避光操作

喹烯酮是喹噁啉类药物，见光易分解的，试验过程应注意避光操作，对照溶液应存放在棕色溶剂瓶中，试样上机液也应盛放于棕色样品瓶中。

5 结论

本文研究了饲料原料乳清粉中喹烯酮药物提取方法、净化方法对试验结果的影响，建立了采用甲酸酸化的80%乙腈提取饲料原料乳清粉中的喹烯酮，PRiME HLB 固相萃取净化，高效液相色谱串联质谱联用仪测定喹烯酮的含量的方法。经试验，确定了方法的线性范围、灵敏度，同时验证了试验方法的准确度、精密度，填补了饲料原料乳清粉中喹烯酮含量检测的技术空白。