调强放疗联合TP化疗对晚期食管癌患者血清microRNA-21水平及预后的影响

吴光辉 李 伟 郭东栋

近期有文献报道，放疗联合化疗可显著提高晚期食管癌的治疗效果[1]，对患者生存质量的改善及生存时间的延长具有潜在价值。值得注意的是，近年研究指出靶向抑制血清微小RNA-21(microRNA-21)可抑制食管癌的发展，是食管癌治疗的重要靶标之一。在本次研究中，我们选取了本院确诊的晚期食管癌患者300例，随机给予单独TP化疗与调强放疗联合TP化疗，通过对两组患者血清microRNA-21水平、治疗效果、生存时间进行比较，旨在探究调强放疗联合TP化疗对食管癌患者血清microRNA-21水平及预后的影响，以期为晚期食管癌的治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集本院2012年10月至2015年12月确诊的晚期食管癌患者共300例，包括男性226例，女性74例，平均年龄(57.42±10.34)岁。其中鳞癌206例，腺癌70例，腺鳞癌24例。患者均为首次住院且经内镜组织学检查确诊为食管癌，且TNM分期均为Ⅲ～Ⅳ期。食管癌的分期参照国际抗癌联盟(union for international cancer control，UICC)与美国癌症联合会(american joint committee on cancer，AJCC)联合发布的第八版食管癌TNM分期系统[2]。由研究人员对患者的吸烟史、饮酒史、体重指数(body mass index，BMI)等基本资料进行采集。所有研究对象均排除其他系统恶性肿瘤、糖尿病、严重的心脑血管疾病及自身免疫性疾病。本研究的开展经医院伦理委员会批准。

1.2 研究对象的分组与治疗方案

采用随机数表法将患者分为观察组(n=150)与对照组(n=150)。两组患者均给予TP化疗：于第7、14 d 静脉滴注多西紫杉醇75 mg/m2各1次，1 h；第1、7、14 d 静脉滴注顺铂25 mg/m2各1次。观察组在此基础上给予调强放疗：患者固定于治疗床架后，设置体表标志并行薄层增强CT 扫描定位，患者于平静呼吸下行强化薄层无间隔连续扫描。将所得CT 图像传输至CMS-XIO调强治疗计划系统中，勾勒靶区及敏感器官轮廓、设定内边界值、摆位边界值，结合靶区处方剂量及敏感器官限量等计算出优选治疗计划。以96%等剂量曲线覆盖计划靶区进行治疗。两组患者均治疗4个月。

1.3 指标检测及疗效评估

所有患者在接受治疗前一天及治疗结束当天，使用含促凝剂采血管抽取患者外周血10 ml，血液标本在1 h内于4 ℃条件下以12 000 g离心力(离心半径为10 cm)离心15 min，收集上层血清备用。按照血清RNA提取试剂盒说明书步骤进行血清总RNA提取。取上述提取的RNA，使用去除基因组逆转录试剂盒逆转录为cDNA，进行实时荧光定量PCR。RT-PCR按照SYBR GREEN说明书进行，反应体系为：Mix 10 μl，上下游引物各0.8 μl，cDNA 2 μl，DEPC水6.4 μl。荧光定量PCR循环条件：95 ℃变性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45个循环，每组设置3个复孔。microRNA-21与GAPDH引物序列为：microRNA-21上游引物：5'-AGTGTGTCATAGAGCTTCCTGTTTCATCTCCCAGT-3'下游引物：5'-TGGAACCAGGCCCCAGGGAATCTTTCAGCTGCATT-3'；GAPDH上游引物：5'-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3'，下游引物：5'-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3'。 本次实验中血清microRNA-21和GAPDH基因熔解曲线峰型单一，说明引物没有形成引物二聚体，也没有非特异性扩增。采用2-ΔCt法计算microRNA-21的相对表达量，△Ct值=样本Ct值-GAPDH Ct值。

所有患者在接受治疗前一天及治疗结束当天，由专业医护人员对患者进行卡氏(Karnofsky，KPS)评分，KPS评分由研究人员进行，参照标准如下[3]：⑴正常，无症状和体征，100分；⑵能进行正常活动，有轻微症状和体征，90分；⑶勉强可进行正常活动，有一些症状或体征，80分；⑷生活可自理，但不能维持正常生活工作，70分；⑸生活能大部分自理，但偶尔需要别人帮助，60分；⑹常需人照料，50分；⑺生活不能自理，需要特别照顾和帮助，40分；⑻生活严重不能自理，30分；⑼病重，需要住院和积极的支持治疗，20分；⑽重危，临近死亡，10分；⑾死亡，0分。疗效评估标准参照实体瘤疗效评价标准[4]：①完全缓解(complete response，CR)：肿瘤完全消失且无新病灶出现，持续≥1个月；②部分缓解(partial response，PR)：肿瘤最大直径和最大垂直直径乘积缩小≥50%并持续≥1个月，且其他病变无进行性加重；③稳定(stable disease，SD)：肿瘤最大直径和最大垂直直径乘积缩小<50%，或增大≤25%；④进展(progressive disease，PD)：肿瘤最大直径和最大垂直直径乘积增大>25%。有效率(%)=(CR+PR)/总例数×100%；疾病控制率(%)=(CR+PR+SD)/总例数×100%。

1.4 随访

依据患者纳入研究的时间，治疗后对患者进行30个月电话随访，记录两组患者的生存时间。随访终点为：①30个月内患者死亡；②30个月内患者退出该项研究；③30个月随访结束。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 两组患者的基本临床资料

两组患者的基本临床资料，见表1。两组患者在年龄、性别组成、BMI、吸烟史、饮酒史、KPS评分、血清microRNA-21水平等方面的差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

表1 两组患者的临床资料比较

2.2 疗效

CR、PR、SD、PD例数观察组分别为0、87、19、44例；对照组分别为0、48、23、79例。如表2所示，与对照组相比，观察组患者的microRNA-21水平降低，而KPS 评分、治疗有效率与疾病控制率均高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 两组疗效比较

2.3 生存分析

经30个月随访，共198例患者死亡，其中观察组死亡80例，对照组死亡118例，无失访。相比于观察组(中位生存时间28个月)，对照组(中位生存时间为16个月)患者的生存时间显著缩短(χ2=21.566，P<0.001，图1A)。以治疗结束后microRNA-21水平的中位数将300例患者分为低microRNA-21水平组和高microRNA-21水平组，相比于低microRNA-21(中位生存时间23个月)，高microRNA-21(中位生存时间为16个月)患者的生存时间显著缩短(χ2=6.927，P=0.008，图1B)。

注：A为观察组与对照组的生存分析比较；B为高microRNA-21组与低microRNA-21组生存分析比较。

3 讨论

食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，对人类健康构成了巨大的威胁[5]。由于早期症状不明显，多数食管癌患者就诊时已发展至中晚期[6]。目前，针对晚期食管癌患者的治疗方案包括化疗、放疗、放化疗联合治疗等[7]。虽然近年来食管癌的治疗技术有所提高，但其五年生存率仍维持在较低水平[8]。

TP化疗是恶性肿瘤最常用的化疗方案之一[7]。据前期文献报道，TP化疗联合放疗对晚期食管癌患者疗效显著[9]。本次研究结果进一步证实，调强放疗联合TP化疗可显著提高治疗效果，改善患者生存质量，并延长患者生存期。此外，本研究还进一步发现，调强放疗联合TP化疗提高疗效的作用很可能是通过靶向调控microRNA-21表达水平实现的。此前，已有文献报道microRNA-21在多种肿瘤如乳腺癌、结直肠癌、食管癌患者体内均存在异常表达，且参与了肿瘤的发生与转移[10-11]。吕红博等[11]通过对100例食管癌患者的血清microRNA-21水平进行检测分析发现，microRNA-21水平在有淋巴转移、ⅡB+Ⅲ期以及低分化癌患者体内的表达水平较高，提示microRNA-21具有评估食管癌预后的潜能。随后体外实验证实，microRNA-21具有促进食管癌细胞增殖与迁移、抑制其凋亡的作用，并参与了食管癌耐药的发生[12-13]。上述结果均表明，靶向抑制microRNA-21可通过多途径抑制食管癌的发展，是食管癌治疗的重要靶标之一。本次研究发现，调强放疗联合TP化疗可显著降低晚期食管癌患者的血清microRNA-21水平，随后的生存分析结果表明，低microRNA-21水平组患者的中位生存期与总生存率均高于高microRNA-21水平组，该结果与前期国内外报道相呼应[11-13]，表明调强放疗联合TP化疗可靶向抑制microRNA-21表达，进而提高疗效，改善患者预后。

本研究尚有以下不足之处：①本次研究收集的病例数有限，未来仍需更多多中心大样本研究对本次研究的结果进行验证；②本研究未对调强放疗联合TP化疗靶向抑制microRNA-21表达的潜在机制进行深入挖掘，未来可设计相应的动物实验和细胞实验进行探究。

综上所述，本次研究首次发现调强放疗联合TP化疗可靶向抑制晚期食管癌患者体内microRNA-21表达水平，并进一步提高治疗效果，改善患者生存质量，有望为晚期食管癌患者的临床治疗提供新途径。