内质网应激IRE-1/XBP-1参与调控肝癌进展的机制研究

歧红阳 王云溪 王志民 吴凤丽 王启明

内质网作为细胞内蛋白质与脂质合成的场所，是1个具有分泌功能并能参与多种生化反应的膜性细胞器，主要功能是包括蛋白质的合成转运修饰和加工，脂类分泌，维持钙稳态等[1-2]。当细胞内出现缺氧、营养缺乏、能量不足及氧化应激等不利因素时，细胞会发生内质网生理功能紊乱、钙稳态失衡，内质网内过量聚积未折叠或错误折叠的蛋白质，进而刺激细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)的发生[3-4]。若内质网应激反应过强或持续时间过久则最终导致细胞凋亡的发生。研究表明，内质网应激与肝癌组织和细胞的增殖、浸润及转移程度明显相关，可通过调节IRE1/XBP、ATF6(Activating Transcription Factor 6)或PERK(PKR-like ER Kinase)信号通路来参与肿瘤的发生发展过程[5-6]。本研究主要通过观察内质网应激发生前后正常肝细胞 LO2、高分化肝癌细胞株HepG2 及高转移能力肝癌细胞株 SMMC-7721 细胞内IRE1/XBP1信号通路的变化，来探讨内质网应激介导的IRE1/XBP1信号通路与肝癌的发生发展的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与ERS诱导

正常LO2肝细胞、高分化HepG2肝癌细胞株及高转移能力SMMC-7721肝癌细胞株细胞购买于上海生命科学研究所。采用DMEM+10%胎牛血清、37 ℃、5%CO2复苏细胞，并进行细胞培养箱中培养，隔天传代后换液，继续培养细胞贴壁生长。LO2、HepG2、和SMMC-7721细胞给予150 mmol/l无水乙醇处理48 h，弃去无水乙醇后用PBS清洗两次，收获细胞备用。

1.2 CCK-8法检测细胞存活率

无水乙醇处理后，制备成LO2、HepG2、和SMMC-7721细胞悬液，并接种于96孔板中过夜培养，隔天更换培养基后依加入CCK8试剂10 μl，37 ℃、5% CO2条件下培养2 h，在450 nm波长处用酶标仪测定OD值，并计算细胞存活率。

1.3 Hoechst 33258 染色荧光显微镜观察细胞凋亡形态学改变

无水乙醇处理后，LO2、HepG2、和SMMC-7721细胞更换培养液后制备成细胞悬液，并接种于6孔板中过夜培养，4%多聚甲酵固定细胞20 min。PBS洗2遍加Hoechst 33258染色液室温孵育10 min。PBS清洗后封片，倒置显微镜下观察并拍照。

1.4 Real-Time PCR检测ERS介导IRE1/XBP mRNA表达含量

收集无水乙醇处理后，Trizol法提取肝癌LO2、HepG2、和SMMC-7721细胞中的总RNA，按照说明书操作，实验采用阈值循环数(cycle threshold,CT)值相对定量法，进行逆转录和Real-time PCR操作，计算不同样本之问的IRE-1、XBP-1、CHOP、Cleaved-caspase 12和Bcl-2 mRNA相对百分比。目的mRNA的量=2-ΔΔCT。

1.5 WesternBlot检测蛋白表达水平

收集无水乙醇处理后，Trizol法提取肝癌LO2、HepG2、和SMMC-7721细胞中的总蛋白，并测定各组细胞蛋白浓度。将各组肝癌LO2、HepG2、和SMMC-7721细胞蛋白样品加入到10%变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳并转膜，封闭40 min加入孵育一抗IRE-1、XBP-1、CHOP、Cleaved-caspase 12和Bcl-2和二抗。用ECL显色液进行显色，并对各泳道条带进行灰度扫描，得出相应的蛋白表达量。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 CCK-8法检测细胞存活率

CCK8检测结果可知，无水乙醇诱导LO2、HepG2、和SMMC-7721细胞发生内质网应激后，细胞存活率显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 CCK-8法检测细胞存活率

2.2 Hoechst33258染色法检测细胞凋亡发生

Hoechst33258染色法结果可知，无水乙醇诱导LO2、HepG2、和SMMC-7721细胞发生内质网应激后，细胞凋亡明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 IRE1/XBP 信号通路mRNA表达含量

采用Real-time PCR法测得结果可知，无水乙醇诱导LO2、HepG2、和SMMC-7721细胞发生内质网应激后，LO2、HepG2、和SMMC-7721细胞内IRE-1、XBP-1、CHOP、Cleaved-caspase 12 mRNA表达含量显著升高，其中细胞内mRNA含量表达的高低次序为SMMC-7721、HepG2 和LO2细胞，差异有统计学意义(P<0.05)；Bcl-2 mRNA表达含量显著降低，细胞内mRNA含量表达的高低次序为LO2、HepG2 和SMMC-7721细胞，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图2 Real-time PCR法检测结果图

2.4 IRE1/XBP信号通路蛋白表达水平

用WesternBlot法测得结果可知，无水乙醇诱导LO2、HepG2、和SMMC-7721细胞发生内质网应激后，LO2、HepG2、和SMMC-7721细胞内IRE-1、XBP-1、CHOP、Cleaved-caspase 12 蛋白表达含量显著升高，其中细胞内蛋白含量表达的高低次序为SMMC-7721、HepG2 和LO2细胞，差异有统计学意义(P<0.05)；Bcl-2 蛋白表达含量显著降低，细胞内蛋白含量表达的高低次序为LO2、HepG2 和SMMC-7721细胞，差异有统计学意义(P<0.05)见图3。

图3 WesternBlot检测蛋白表达含量图

3 讨论

肝癌是1种严重危害人类健康的恶性肿瘤，其发病率和死亡率较高，且呈逐年上升的趋势。肝癌的发病机制尚未明确，通常与机体脂肪性肝炎、乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染等慢性炎症相关。这些致病因素可通过诱导机体出现炎症反应、氧化应激损伤和基因突变等而诱发机体出现细胞内质网应激现象[7-8]。近年来，内质网应激诱导肝癌细胞凋亡已经成为治疗肝癌的研究热点。参与诱导内质网的应激蛋白包括CHOP、GRP78和XBP-1等内质网分子伴侣用于提示ERS的发生。X-盒-结合蛋白-1(X box-binding protein-1，XBP-1)的表达上调可作为ERS的主要标志[9-10]， XBP-1通过调控参与内质网应激的相关蛋白陪衬分子和降解蛋白来发挥其蛋白质的折叠能力。内质网应激发生时可有效刺激具有蛋白激酶和核糖核酸酶活性的内质网膜的肌醇酶 1( inositolrequiring1,IRE1) 二聚化，并招募TRAF2以及ASK1共同形成IRE-1-TRAF2-ASKl复合物，启动JNK下游凋亡信号；并可将XBP1-U 剪接成具有高度转录活性的 XBP1-S，在转录水平调节蛋白质折叠的相关基因表达[11-12]。生长停滞及DNA损伤诱导基因153(CHOP)作为ERS凋亡途径被激活的主要标志之一[13-14]。CHOP 的表达在正常细胞的情况下非常少，内质网应激发生，PERK、ATF6 转录的大量诱导时时CHOP 的表达量在转录水平上显著增加，CHOP的表达被上调从而加速细胞凋亡的发生，引起细胞分裂周期停滞及DNA 损伤，并抑制抗凋亡相关基因 BCL-2和增强凋亡相关蛋白Caspase12表达激活的Caspase-12移位到细胞质逐步激活Caspase-9和Caspase-3,最终导致细胞凋亡[15-16]。

本实验中显示无水乙醇诱导LO2、HepG2、和SMMC-7721细胞发生内质网应激后，细胞存活率显著降低，细胞凋亡明显升高，说明大量的内质网应激可以刺激肝癌细胞的凋亡发生。同时，无水乙醇诱导LO2、HepG2、和SMMC-7721细胞发生内质网应激后，LO2、HepG2、和SMMC-7721细胞内IRE-1、XBP-1、CHOP、Cleaved-caspase 12 mRNA和蛋白表达含量显著升高，其中细胞内mRNA和蛋白含量表达的高低次序为SMMC-7721、HepG2 和LO2细胞；Bcl-2 mRNA表达和蛋白含量显著降低，其中细胞内mRNA和蛋白含量表达的高低次序为LO2、HepG2 和SMMC-7721细胞说明内质网应激相关蛋白IRE-1、XBP-1和CHOP被IRE-1/XBP-1信号通路激活，进而引发凋亡蛋白Caspase12释放，促进和加速肝癌细胞的死亡，且随着肝癌细胞恶性程度的增高，内质网应激及IRE-1/XBP-1信号通路表达更为明显。综上所述，内质网应激发生后LO2、 HepG2 和SMMC-7721 细胞中IRE-1/XBP-1的表达水平显著升高，有效参与调控肝癌细胞的增殖发展，可为治疗肝癌提供有效的实验依据，并为未来临床治疗肝癌的定向靶点提供有效的基础。