蛋白酶体抑制剂MG132对膀胱癌细胞增殖及凋亡的影响

何波，王文瑞，李健，王平

（中国医科大学附属第四医院泌尿外科，沈阳 110032）

膀胱癌是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤，90%以上为移行上皮细胞癌［1］。至今，膀胱癌的治疗进展缓慢。因此，迫切需要寻找有效的膀胱癌治疗方法［2］。

蛋白质的动态平衡是大多数真核细胞生长过程中必不可少的。其中，在蛋白质降解系统里，泛素-蛋白酶体系统 （ubiquitin proteasome system，UPS）扮演着至关重要的作用，该系统降解细胞内85%以上的蛋白质［3］，参与多种细胞功能，与肿瘤关系密切［4-7］。近年来，以泛素-蛋白酶体系统作为抗癌治疗靶点的研究越来越多。美国食品药品监督管理局陆续批准使用蛋白酶体抑制剂 （硼替佐米、卡非佐米） 治疗多发性骨髓瘤和其他一些血液系统肿瘤。事实上，蛋白酶抑制剂已经证明了干预癌症的治疗潜力。MG132是一种常用的蛋白酶体抑制剂，文献［8-11］报道，MG132可以促进多种癌细胞的细胞凋亡及逆转某些恶性特征，是一种潜在的抗肿瘤药物。本研究拟探讨MG132对膀胱癌细胞增殖及凋亡的影响，旨在为膀胱癌寻找新的治疗药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

膀胱癌细胞系 （BIU87、 T24，中科院上海生命科学研究院） ，1640培养基 （美国Gibco公司），FBS（美国Gibco公司），兔抗人caspase-3抗体、兔抗人β-Tubulin抗体、辣根过氧化物酶连接的抗兔二抗 （美国Thermo Fisher公司），CCK-8试剂盒 （日本同仁），Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒 （BD 生命科学公司），MG132 （德国Calbiochem 公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：2种膀胱癌细胞系由RPMI 1640完全培养液 （含10% FBS、1%青-链霉素双抗） 在37 ℃、5% CO2恒温细胞培养箱中培养，用 0.25% 胰酶溶液（内含EDTA） 进行消化传代，取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2 MG132处理膀胱癌细胞：首先用稀释剂 （按DMSO与无水乙醇1∶1的比例配制而成） 将MG132溶解为一定浓度。将细胞分为培养液处理的MOCK组 （空白对照组）、只加稀释剂的NC组 （阴性对照组）和实验组。实验组又进一步按不同药物终浓度、不同药物干预时间分组。将MG132按终浓度0、1、2、3、4、6、8、10 μ mol/L，分别于0、1、2、4、8、12、24、48 h作用于BIU87膀胱癌细胞，CCK-8检测MG132对膀胱癌细胞增殖的影响，筛选出最佳药物终浓度、最佳药物作用时间。经筛选，后续实验按药物最佳干预条件进行。

1.2.3 CCK-8检测细胞增殖活力：提前分好组，然后在96孔板中接种膀胱癌细胞并过夜，待细胞融合度达80%～90%时按上述MG132干预细胞的方法加入MG132。在37 ℃、5% CO2恒温培养箱孵育细胞适当时间。然后更换为110 μ L （10 μ L CCK-8原液+100 μ L培养基） 含CCK-8的RPMI1640培养基，放入恒温孵育箱继续培养1～4 h；用酶标仪测定在450 nm处的吸光度，并绘制细胞增殖曲线。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡：按实验分组，提前1 d接种膀胱癌细胞于6孔板中，按药物最佳干预条件给予MG132处理。细胞孵育适当时间后，用不含EDTA的胰酶消化收集贴壁细胞。用预冷 （4 ℃） PBS冲洗重悬细胞2次，室温1 000 r/min离心3 min，收集细胞沉淀。加入300 μ L的1×结合缓冲液悬浮细胞，加入5 μ L Annexin V-FITC混匀后，避光室温孵育15 min。上机前5 min加入5 μ L的PI染色进行标记。上机前补加200 μ L的1×结合缓冲液。最后上机进行检测。

1.2.5 Western blotting：MG132处理膀胱癌细胞后，提取细胞蛋白，用BCA 法检测总蛋白浓度，绘制标准曲线，计算蛋白浓度并加以调整和处理。蛋白样品进行凝胶电泳，120 V恒压电泳，电泳时间约2～3 h。110 mA恒流90 min转膜，转膜完毕后，观察marker条带是否清晰来判断是否转膜成功。用3% BSA室温封闭1～2 h，封闭后用TBST冲洗1次，5 min。然后行抗体孵育，一抗4 ℃孵育过夜 （或室温4 h），TBST洗涤3次，二抗室温孵育1～2 h，TBST洗涤3次。ECL发光，采用Image J软件行结果分析。

1.3 统计学分析

实验数据统计分析及作图均采用 SPSS 20.0 软件、Graphpad prism 6.0，组间均数比较采用t检验，2组以上数据的比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MG132对膀胱癌细胞增殖活力的影响

用不同终浓度及不同处理时间的MG132干预BIU87膀胱癌细胞，结果显示，在24 h与48 h生长曲线上，阴性对照组与空白对照组的OD450值比较，差异无统计学意义 （P > 0.05）。表明MG132的稀释剂对BIU87膀胱癌细胞增殖活力无明显影响。且在相同处理时间下，与空白对照组比较，随着MG132浓度的增加，BIU87膀胱癌细胞增殖活力逐渐减低，即MG132对其细胞增殖的抑制作用逐渐增强，差异有统计学意义 （P < 0.05），结果呈现出浓度依赖性的关系，即当浓度为≤2 μ mol/L，对细胞增殖的抑制作用的浓度曲线趋势较陡。当浓度>2 μ mol/L时，对细胞增殖的抑制作用逐渐趋于平稳。在相同浓度处理条件下，MG132处理时间48 h对细胞增殖的抑制作用明显高于MG132处理时间24 h （P < 0.05）。经浓度筛选，选取2 μ mol/L为MG132药物处理浓度。在MG132药物处理浓度为2 μ mol/L的条件下，随着药物作用时间的增加，对BIU87及T24膀胱癌细胞增殖活力的抑制作用逐渐增强 （P < 0.05），结果呈现出时间依赖性关系。当处理时间≤24 h，对细胞增殖的抑制作用的浓度曲线趋势较陡。当处理时间>24 h，对细胞增殖的抑制作用逐渐趋于平稳。故后续实验选取24 h为MG132药物处理时间。见图1。

2.2 流式细胞术检测细胞凋亡率

图1 MG132对BIU87及T24膀胱癌细胞增殖活力的影响Fig.1 Effects of MG132 on cell proliferation of BIU87 and T24 bladder cancer cells

选取药物终浓度2 μ mol/L 、处理时间24 h为最佳药物干预条件，处理BIU87及T24 2种膀胱癌细胞。BIU87与T24膀胱癌细胞对照组的细胞总凋亡率分别为7.30%±0.36%和11.65%±0.050%，实验组的细胞总凋亡率分别20.23%±0.60%和27.95%±0.55%。2种膀胱癌细胞实验组与对照组比较，细胞总凋亡率均明显升高，差异均有统计学意义 （P < 0.05）。见图2。

图2 MG132对膀胱癌细胞总凋亡率的影响Fig.2 The effect of MG132 on apoptosis rate of bladder cancer cells

2.3 Western blotting检测MG132对caspase-3 蛋白表达的影响

以最佳药物干预条件处理BIU87及T24 2种膀胱癌细胞后，Western blotting检测活化caspase-3（cleaved caspase-3） 蛋白表达，定量分析结果显示，BIU87与T24膀胱癌细胞对照组cleaved caspase-3蛋白相对表达量分别为0.27±0.03和0.24±0.01，实验组cleaved caspase-3蛋白相对表达量分别为0.75±0.01和0.92±0.01。2种膀胱癌细胞实验组与对照组比较，实验组cleaved caspase-3蛋白相对表达量明显上调，差异均有统计学意义 （P < 0.05）。见图3。

3 讨论

图3 Cleaved caspase-3 蛋白的相对表达量Fig.3 The relative expression of cleaved caspase-3

膀胱癌是世界上第五大常见癌症，同时也是泌尿系统最常见的恶性肿瘤［1，12］。超过80%的膀胱癌为非肌层浸润性膀胱癌，其余约20%为肌层浸润性膀胱癌或转移性膀胱癌，非肌层浸润性膀胱癌5年生存率约94%，肌层浸润性膀胱癌的5年生存率约50%，而转移性膀胱癌5年生存率则下降到20%以下［13］。早期发现膀胱癌对于改善患者的预后和总体存活率至关重要。同时，膀胱癌治疗的进展也很缓慢。因此，膀胱癌的发生发展机制以及新的治疗方法仍是目前研究的重点。

研究［9，14］表明，泛素-蛋白酶体系统参与了细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、DNA修复、蛋白质折叠等多种细胞功能，与肿瘤、神经变性性疾病等疾病关系密切，该系统为癌症治疗提供了新的治疗靶点。研究［15-16］显示，使用蛋白酶体抑制剂可促进多种癌细胞的凋亡，如蛋白酶体抑制剂硼替佐米用于治疗多发性骨髓瘤患者、套细胞淋巴瘤，已成为蛋白酶体抑制剂用于抗肿瘤治疗的先例，二代抑制剂目前正处于临床研发阶段。MG132是一种常用的蛋白酶体抑制剂，有文献报道MG132可以诱导骨肉瘤［9］、甲状腺癌［8］、前列腺癌［17］、肺癌［18-19］、胆囊癌［20］等多种肿瘤细胞凋亡，是一种潜在的抗肿瘤药物。本研究运用CCK8及流式细胞术检测MG132对BIU87及T24 2种膀胱癌细胞的增殖活力和凋亡的影响，同时筛选出最佳药物终浓度、最佳药物作用时间。结果显示，MG132可以明显抑制膀胱癌细胞增殖活力及促进细胞凋亡，并呈现出浓度和时间依赖性。本研究还应用Western blotting定量检测分析了MG132对凋亡相关蛋白caspase-3活性的影响。caspase家族在细胞凋亡的过程中起着十分重要的作用，其中，caspase-3是关键的凋亡执行者，正常条件下，caspase-3以酶原的形式存在于细胞内，在多种凋亡信号刺激下，它被激活为cleaved caspase-3，最终导致细胞凋亡［19，21］。本研究结果显示，与对照组相比较，2种膀胱癌细胞实验组的cleaved caspase-3蛋白相对表达量明显上调，差异均有统计学意义 （P < 0.05）。

综上所述，蛋白酶体抑制剂MG132可以明显抑制膀胱癌细胞增殖活力，并呈现出浓度和时间依赖性，同时也可以诱导膀胱癌细胞凋亡。