硫胺素及溶氧对解脂亚洛酵母联产酮酸的影响

彭小雨， 曾伟主， 周景文， 徐国强*

(1.江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡 214122; 2.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室， 江苏 无锡 214122；3.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122)

α-酮戊二酸作为重要的二元羧酸，参与微生物体内的三羧酸循环和氨基酸代谢，在碳氮平衡的中间代谢过程中起着至关重要的作用[1]。丙酮酸又称2-氧代丙酸、α-酮基丙酸、乙酰甲酸，是最重要的氧代羧酸之一[2]。丙酮酸参与细胞体内的能量代谢，并在其中扮演着至关重要的角色[3]。此外，丙酮酸主要是作为多种药物合成的前体物质，如L-酪氨酸、L-色氨酸、丙氨酸以及L-多巴[2]。同时，α-酮戊二酸和丙酮酸的市场价高达12 000～15 000 美元/kg，在食品、制药、精细化学以及动物饲料等行业均具有广泛的应用[4-5]。目前，α-酮戊二酸和丙酮酸的工业化生产主要以化学合成法为主。由于高昂的生产成本以及环境污染严重等不可避免的缺点限制了酮酸的工业化生产，也决定了化学合成法必将被一些新兴生物技术方法所取代[6]。酶法因具有生产成本低、环保等优点受到学者的关注，但是转化率低是该方法的致命缺点[4,7]。而微生物发酵法不仅对环境污染小，还具有环保性和较高的转化率。因此，利用微生物发酵法生产酮酸是非常具有竞争力的生产方法。本实验室在前期工作中筛选出1株过量积累α-酮戊二酸的硫胺素营养缺陷型菌株YarrowialipolyticaWSH-Z06[8]。但在用菌株YarrowialipolyticaWSH-Z06生产α-酮戊二酸的过程中总是伴随着副产物丙酮酸的积累。研究者们采用了多种策略(如发酵优化、代谢改造)来减少丙酮酸的积累。首先，分别对pH和补料进行调控，从而优化发酵条件来降低丙酮酸的产量[9-11]。虽然取得了较好的效果，但还存在一定的缺陷。通过改造酵母的代谢途径来降低丙酮酸的产量引起了学者的广泛关注。Zhou等[12]尝试通过代谢工程改造的方式来降低丙酮酸的产量，即调节乙酰辅酶A的代谢途径，丙酮酸的产量减少到20.2 g/L。同年，Yin等[13]又通过调节Y.lipolyticaWSH-Z06细胞内丙酮酸羧化途径来控制丙酮酸的代谢，最后丙酮酸的产量从35.2 g/L降到了13.5 g/L。但是却不能完全将副产物丙酮酸消除。α-酮戊二酸和丙酮酸联产作为一种新思路被本研究室前期工作者提出[14]。α-酮戊二酸和丙酮酸的市场价格比较接近以及具有广泛的应用价值，使α-酮戊二酸和丙酮酸联产更具经济性。此外，随着现代分离技术的快速发展，对于有机酸分离的报道也很多[15-17]。尤其是反应萃取法在分离丙酮酸方面越来越受关注，并取得了较好的结果[18-19]。这也为α-酮戊二酸和丙酮酸的联产提供了可行性依据。本研究预通过优化发酵条件达到α-酮戊二酸和丙酮酸联产产量最大化，为后续的分离提取做准备，也为实现α-酮戊二酸和丙酮酸工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株YarrowialipolyticaWSH-Z06 C3(保藏编号为CCTCCNO：M20714)，为硫胺素缺陷型菌株，由本研究室前期的工作中诱变选育[8]。

1.1.2 培养基(g/L) 种子培养基：葡萄糖 20，大豆蛋白 10，磷酸氢二钾 1.0，硫酸镁 0.5。固体培养基中加入20琼脂。115 ℃灭菌15 min。发酵培养基：粗甘油100，乙酸钠 6，硫酸铵 3，磷酸二氢钾 3， 硫酸镁 1.2，氯化钠 0.5，磷酸氢二钾 0.1，硫胺素6×10-7(过滤除菌)，115 ℃灭菌15 min。

1.1.3 仪器与设备 ZYZQ-VAF型恒温培养箱，上海医疗器械研究所；HH-B11·420BS型电热恒温摇床，上海跃进医疗器械有限公司；Eppendorf 5418高速离心机，德国Eppendorf 公司；UV-2450型紫外-可见光分光光度计，日本Shimadzu公司；Agilent 1260高效液相色谱仪，美国Agilent公司；T&J-Dtype 15 L发酵罐，上海迪必尔生物技术有限公司；G154DWS型高压灭菌锅，无锡医疗器械厂。

1.2 方法

1.2.1 培养方法 ①菌种活化：从-80 ℃保存的甘油管里蘸取一定量的菌，在平板上划线培养大约48 h之后，挑取单菌落于500 mL液体培养基中，其中装液量为50 mL，培养时间17～18 h，培养温度28 ℃，转速200 r/min；②一级种子培养：取100 μL液体活化好的菌种，用接种环将其划线于茄型瓶中，培养时间24 h，培养温度28 ℃；③二级种子培养(摇瓶)：将茄瓶活化好的菌种挑取1环左右接种于500 mL种子培养基中，其中装液量50 mL，培养时间17～18 h，培养温度28 ℃，转速200 r/min；④摇瓶培养：将培养好的二级种子液接种于灭好菌的摇瓶里，接种量为10% (体积比)，培养温度28 ℃，转速200 r/min；⑤二级种子培养(发酵罐)：将茄瓶活化好的菌种挑取4环左右接种于2 L种子培养基中，其中装液量200 mL，培养时间17～18 h，培养温度28 ℃，转速200 r/min；⑥发酵罐培养：将培养好的二级种子培养液接种于灭好菌的发酵罐中，其中装液量70%，培养温度28 ℃，罐压0.035 MPa，接种量10% (体积比)。转速和通气量根据罐的大小做适当调整。

1.2.2 细胞干重的测定 细胞干重(DCW)的测定根据参考文献[8]：测定在570 nm处菌液的OD值，根据预定标准线换算(OD570∶DCW (g/L) = 0∶0.223)。

1.2.3 α-酮戊二酸、丙酮酸以及甘油的测定 取800 μL发酵液于14 000 r/min下离心3 min，将上清液稀释适当的倍数，然后经0.22 μm水系滤膜过滤，进行高效液相色谱分析。

1.2.4 色谱分析条件 根据参考文献[8]色谱条件为流动相 5 mmol/L H2SO4，流速 0.6 mL/min，柱温 40 ℃，注射量 10 μL，检测器、紫外吸收检测器和示差折光检测器，波长 210 nm。

2 结果与分析

2.1 摇瓶水平上发酵条件的确定

2.1.1 氮源浓度对酮酸联产的影响 种子液的活力对于发酵产酸效果有很大的影响，当种子液的活力很强时，不仅有利于菌体的快速生长，而且还能维持较强的产酸能力。而在整个种子液活化过程中，氮源作为种子液培养基中的重要组成部分，主要用于微生物的生长和含氮代谢物的合成[20]。本研究主要以大豆蛋白粉为氮源，考察了8种不同的氮源浓度对于酮酸联产的影响。根据酮酸在发酵过程中的积累情况来确定种子培养基的最佳氮源浓度。由图1可知，丙酮酸随着种子液中氮源浓度的增加而降低，而菌体干重的变化趋势和丙酮酸的变化趋势相反。可能的原因是，在较低的氮源浓度下，菌体生长缓慢，进而导致发酵液中的溶氧升高，而高溶氧又有利于丙酮酸的积累。当氮源浓度为6 g/L时，α-酮戊二酸产量达到最高，为14.9 g/L。但是当氮源浓度为4 g/L时，酮酸总产量最高。所以从酮酸的总产量来说，当氮源浓度为4 g/L时，有利于酮酸的积累。

图1 种子液中不同氮源浓度对发酵的影响Fig.1 Effects of various nitrogen concentration in the seed culture on fermentation

2.1.2 接种密度对酮酸联产的影响 接种量的大小对产物的形成有一定的影响。接种量过低，会延长发酵周期；接种量过大，菌体快速生长，容易导致溶解氧不足而降低产物的积累。基于此，本研究主要在摇瓶水平上考察了2组不同的初始OD值(5、15)对酮酸联产的影响，分别考察每组接种体积的不同百分比对酮酸联产的影响。由图2A可知，当初始接种量OD值为5，接种量在1%～6%(体积分数)之间时，酮酸的总产量没有显著变化，平均在27.6 g/L，α-酮戊二酸和丙酮酸分别为16.2、11.4 g/L；当接种体积大于6%时，α-酮戊二酸和丙酮酸的产量较之前都有所提高，尤其当接种体积为12%时，酮酸总产量高达39.9 g/L，α-酮戊二酸和丙酮酸的产量分别为19.2、20.7 g/L，比之前1%～6%(体积分数)提高了18.5% (16.2 g/L)、81.6% (11.4 g/L)。

由图2B可知，当初始接种量OD值为15，接种量为6%(体积分数)时，酮酸总产量达到最大，为23.9 g/L。但是从初始接种量OD值的角度来比较，可以很明显地观察到，当初始接种量OD值为5时的酮酸的总产量普遍高于初始接种量OD值为15时的酮酸总产量。可能的原因是，初始接种量过高会导致菌体消耗甘油快速生长，而不利于有机酸的积累；当菌体量过低，甘油利用率降低，也会延长整个发酵周期。综合考虑，最佳接种条件为初始OD值5，接种量12%(体积分数)。

图2 接种量对发酵联产酮酸的影响Fig.2 Effects of inoculation concentration on fermentationA：初始OD值为5；B：初始OD值为15A： InitialODvalue was 5; B： InitialODvalue was 15

2.2 发酵罐水平上硫胺素浓度对酮酸联产的影响

实验菌株YarrowialipolyticaWSH-Z06 C3为硫胺素营养缺陷型菌株。硫胺素是丙酮酸脱氢酶复合体和α-酮戊二酸脱氢酶复合体的辅因子。此外，在酵母代谢途径中，丙酮酸在丙酮酸脱氢酶复合体的协同作用下转变为乙酰辅酶A和二氧化碳，而α-酮戊二酸脱氢酶复合体又是调控三羧酸循环的关键点。所以说在酵母联产酮酸的发酵过程中，硫胺素是一个至关重要的因素。本研究在15 L发酵罐水平上考察了4种不同浓度的外源硫胺素对于酮酸联产的影响。

由图3可知，在4种不同硫胺素浓度条件下，当硫胺素浓度为0.2 μg/L时，α-酮戊二酸和丙酮酸的总产量最高，为78.2 g/L，比优化前产量提高了57.9%。但是丙酮酸的产量因硫胺素浓度变化差异比较显著。随着硫胺素浓度的下降，丙酮酸产量反而升高；推测可能是硫胺素浓度影响了丙酮酸脱氢酶复合体系的酶活。硫胺素作为丙酮酸脱氢酶复合体系的辅因子形式存在，随着初始硫胺素浓度的降低，丙酮酸脱氢酶复合体系的酶活降低，抑制了丙酮酸转化为乙酰辅酶A和CO2，从而导致流入三羧酸循环途径的碳代谢流减少。而对于α-酮戊二酸的产量变化不大，主要包括两方面原因。一方面流入三羧酸循环的碳通量减少，进而导致α-酮戊二酸的产量减少。其次，硫胺素的缺乏抑制了α-酮戊二酸脱氢酶复合体系的酶活，减少了α-酮戊二酸的分解代谢。这和早期本实验室在摇瓶水平上做的硫胺素浓度的优化结果基本上趋于一致[8]，随着硫胺素浓度的增加，菌体干重增加，丙酮酸产量降低。当硫胺素浓度在一定范围区间，α-酮戊二酸的产量不会受到很大的影响。这也说明找到一个合适的硫胺素浓度对于酮酸联产具有很重要的意义。

2.3 发酵罐水平上溶氧对酮酸联产的影响

2.3.1 不同溶氧水平对酮酸联产的影响 氧是影响微生物生理和代谢的重要环境因子，尤其在微生物发酵过程中，溶氧会影响发酵的稳定性[21]。再加上实验菌株YarrowialipolyticaWSH-Z06 C3属于好氧菌株，溶氧水平的变化会影响菌体的生长、代谢途径以及产物积累情况。所以本研究在15 L发酵罐水平上考察了4种不同溶氧水平(10%、30%、50%、75%)对YarrowialipolyticaWSH-Z06 C3联产酮酸的影响。结果如图4所示，随着溶氧水平的提高，菌体快速生长，加快了甘油的消耗，能够有效地缩短发酵时间。溶氧水平在10%～50%之间，发酵前120 h时，α-酮戊二酸产量随着溶氧水平的提高而提高。但是在发酵后期，较低的溶氧有利于α-酮戊二酸的快速积累。研究表明，在低溶氧条件下，流入三羧酸循环的代谢通量减少；在高溶氧条件下，流入三羧酸循环的代谢通量增加[22]。α-酮戊二酸属于三羧酸循环的中间产物，进而生成较多的α-酮戊二酸。所以α-酮戊二酸产量在30%～50%溶氧水平下高于在10%溶氧水平下。而30%溶氧水平高于50%溶氧水平，推测可能是在30%的溶氧水平下糖酵解途径生成丙酮酸与三羧酸循环达到碳平衡。在75%高溶氧水平下，α-酮戊二酸和丙酮酸产量反而下降。推测在高溶氧条件下，细胞呼吸加快，产生过量的ATP；而过量的ATP又会抑制糖酵解途径中的关键酶，进而导致丙酮酸生产速率下降[23]。细胞溶氧水平在10%～50%之间时，随着溶氧水平的提高，丙酮酸产量增加。可能的原因是，在溶氧较充足条件下，NADH通过呼吸链氧化，糖酵解速率更快，从而导致丙酮酸产率提高[24]。

图3 不同硫胺素浓度中甘油消耗、α-酮戊二酸、丙酮酸、菌体浓度的变化情况Fig.3 Time courses of glycerol,α-ketoglutaric acid,pyruvic acid and dry cell weight under different thiamine concentrations

图4 不同溶氧水平中甘油消耗、α-酮戊二酸、丙酮酸、菌体浓度的变化情况Fig.4 Time courses of glycerol,α-ketoglutaric acid,pyruvic acid and dry cell weight in different dissolved oxygen level

2.3.2 阶段溶氧调控策略对酮酸联产的发酵情况 根据2.3.1的结果可知，较高的溶氧水平有利于菌体的生长和甘油的消耗，相对较低的溶氧水平不仅有利于酮酸的积累，而且可以减少无效的ATP消耗。因此为了使菌株的生长情况和产酸能力达到最佳，对溶氧水平进行了阶段调控策略。在发酵前期溶氧水平设定为50%，当菌体干重达到8 g/L时，溶氧水平控制为30%，直到发酵结束。结果如图5所示，采用两段溶氧调控策略以后，即能保持较高的转化率(0.65 g/g)和生产强度(0.54 g/(L·h))，在120 h酮酸总产量高达64.7 g/L，相比于30%和50%的溶氧水平酮酸总产量分别提高了74.9%和21.2%。采用两阶段溶氧调控可以实现酮酸联产的高生产量、高产率和高生产强度的相对统一。

图5 15 L发酵罐阶段调控对酮酸联产的影响Fig.5 Effect of two-stage control on the co-production of keto acids in 15 L fermentor

3 讨 论

本研究探索了不同条件对酮酸联产的影响，发现硫胺素浓度以及溶氧水平对于酮酸联产具有很大的影响。当硫胺素的浓度为0.2 μg/L时，酮酸总产量高达78.2 g/L，对比优化前产量提高了57.9%。解脂亚洛酵母属于硫胺素营养缺陷型菌株。低浓度硫胺素有利于酮酸的联产，但是菌体密度降低，进而甘油消耗减慢，发酵周期延长。这也是采用低浓度硫胺素联产酮酸的不足。在保证酮酸产量的同时，通过适当提高硫胺素的浓度来缩短发酵周期。此外，通过对比不同溶氧水平酮酸联产的情况发现，较高溶氧有利于菌体快速生长，发酵周期也大大缩短，但是不利于酮酸的积累。低溶氧水平不仅不利于酮酸的积累，也大大延长了发酵周期。根据所得结果发现，在菌体生长阶段，溶氧水平调控在50%左右；在代谢积累产物阶段，溶氧水平控制在30%左右，有利于提高酮酸的总产量。同时也会大大缩短发酵周期，提高生产效率，也将为酮酸联产实现工业化提供参考。