鼓膜组织工程学研究进展

黎欢 胡益 姚旭 吴淋蓉 沈毅

[摘要] 鼓膜穿孔是耳鼻喉科常见的临床症状，慢性鼓膜穿孔治疗主要通过手术修补，各种自体移植材料常被作为移植物来修补穿孔鼓膜。近年来，鼓膜再生领域的研究逐渐趋向于应用组织工程学治疗技术。许多新型组织工程材料在鼓膜修复中体现出良好的鼓膜再生和听力重建效果。然而，组织工程鼓膜的制作需要考虑多种因素。本综述通过总结概括目前在鼓膜穿孔修复中所使用的支架材料、生物活性分子和細胞来阐述鼓膜再生的组织工程学研究进展。

[关键词] 鼓膜穿孔;组织工程学;支架;生物活性分子

[中图分类号] R764          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）08-0164-05

[Abstract] Tympanic membrane（TM） perforation is a common clinical symptom in the department of otolaryngology. Presently， chronic TM perforation is mainly treated by surgery， with various graft materials （e.g. autologous cartilage and fascia） being used as patches to repair TM perforations. Resent research in the field of TM regeneration tends to the tissue engineering techniques. These tissue-engineered materials have showed good results in perforation closure and acoustic function reconstruction. However， various factors need to be considered in the manufacture of bio-engineered TM. This review describes the advances in research of TM tissue engineering by summarizing the scaffold materials， bioactive molecules （BMs） and cells currently used for TM wound healing.

[Key words] Tympanic membrane perforation; Tissue engineering; Scaffold; Bioactive molecule

鼓膜穿孔是耳科常见症状，多由慢性化脓性中耳炎或耳外伤所致。慢性鼓膜穿孔会导致听力下降、反复中耳感染和胆脂瘤[1]。慢性化脓性中耳炎引起的鼓膜穿孔甚至会导致严重的颅内外并发症[2]。目前治疗慢性穿孔的方法通常是实施鼓膜修补手术，运用各种自体组织（包括颞肌筋膜、软骨、脂肪、软骨膜）来修补穿孔鼓膜。尽管这些材料有一定效果，但都有其局限性。自体移植会损伤自身组织，并且在二次手术时取材受限。另一方面，同种异体移植物和异种移植物具有潜在的感染风险[3]。更重要的是，这些移植物均不能复制出原始鼓膜复杂的精细结构和声学振动特性[4]。近年来，随着现代医学材料学和组织工程学的发展，我们看到了从简单鼓膜移植物到组织工程人工鼓膜的演变。组织工程鼓膜的出现在鼓膜的修复治疗中具有变革意义。

1 鼓膜组织工程学概念

组织工程学是通过体内或体外的方式实现：体内途径是在组织培养或者生物反应器中重建器官，包括细胞和支架材料，而体外方法则是用非细胞支架的生物材料，拥有有助于细胞募集和分化的生物特性[5]。组织工程中三大重要的元素是支架材料、生物活性分子和细胞。支架材料为细胞增殖、迁移提供机械支撑，生物活性分子（bioactive molecules，BMs）则为细胞分化提供适宜的生化微环境。重要的是，这个工程的创建应该相互作用，在组织生长的开始和维持中要有动态交互性[6]。运用组织工程学概念进行鼓膜再生，可以为鼓膜穿孔提供更优的治疗方法。

2 支架材料

2.1 脱细胞组织

脱细胞组织支架（同种异基因或异种）去除了细胞成分而保留大部分原来细胞外基质的生物活性和机械特性。这些支架最主要的优点是在微结构、成分和生物化学特性上与原组织的细胞外基质非常接近，然而，不同的供体组织也会有不同的变化。例如，脱细胞真皮基质（acellular dermal matrix，ADM）是由人类同种异基因供体组织加工而成的，是一种冷冻干燥的脱细胞的真皮内基质和防腐的基底膜组成[7]。当ADM用于治疗鼓膜穿孔时，它在组织学上常显示炎症反应带，伴随大量成纤维细胞浸润、上皮增生和新生血管形成[8，9]。近期的动物实验证明，在豚鼠模型中使用同种异体皮肤脱细胞支架材料修复鼓膜穿孔是安全有效的[10]。并且临床试验中发现，该材料能较易融入新生组织中且不会引起明显的免疫反应，鼓膜修复效果理想[11]。其他脱细胞支架材料包括猪小肠黏膜脱细胞基质（SurgisisR）、猪膀胱脱细胞基质（urinary bladder matrix，UBM）、猪软骨脱细胞基质（decellularized extracellular cartilage matrices，DECM）等[12-14]。SurgisisR是一种脱细胞猪小肠黏膜下基质，由胶原蛋白、纤连蛋白和糖胺聚糖组成，已被证实可促进鼓膜再生，但会导致明显的炎症反应和材料残余[12]。UBM由膀胱基质脱细胞后的黏膜层和固有层组成，可提供一个完整的可供上皮移行的基膜支架。UBM补片较易与鼓膜组织相融且吸收完全，最终使再生的鼓膜具有正常的三层超微结构[13]。DECM支架在最新的体外研究中证实，在体外常压和负压下，其声学振动特性在一定程度上与人鼓膜非常接近，可提供振动特性和高效声透射的重要声学要求，故DECM为鼓膜声学传导功能的重建提供了一个选择，但其在人体内的声学传导特性还需进一步的体内实验研究[14]。

2.2 多聚物

多聚物是比较理想的支架材料，因其具有有效性、生物相容性、生物可降解性、易操控性和规模化生产潜能等优点[15]。自然多聚物目前正在作为鼓膜穿孔修复的潜在自然支架被研究和应用，包括明胶海绵、丝素蛋白、壳聚糖、藻酸盐和透明质酸等[3]。（1）明胶海绵：来源于变性的猪皮肤，被广泛地用作中耳填塞材料以支撑移植的鼓膜和听骨[16]。明胶海绵也被用于修补鼓膜穿孔[17]，其无毒，具有良好的生物相容性，易于操作，且能够促进止血;（2）丝素蛋白：通常来源于蚕丝，去除蚕丝外层抗原蛋白后，丝素蛋白被发现可促进多种细胞增殖和迁移，其中包括人鼓膜角质上皮细胞[18，19]，并可为鼓膜再生提供结构支撑;（3）壳聚糖：是甲壳素氮乙酰衍生物，见于自然界中形成甲壳类和昆虫类支撑结构的黏多糖[20]。壳聚糖有抗菌特性，且被证实具有可改善皮肤、骨和肝脏创伤愈合的作用，三维壳聚糖支架材料被证实可在内植法鼓膜成形术中与再生鼓膜融合[21];（4）藻酸盐：是一种来源于海藻的自然有机多聚物，当与钙交联后可提升该材料的可操作性。藻酸钙移植物作为支架可供黏膜上皮细胞和角质上皮细胞生长。但它在理论上有耳毒性风险，目前尚缺乏其安全性和有效性的短期或长期研究[22];（5）透明质酸：是一种存在于黏多糖中的自然物质，已被证实可促进鼓膜穿孔愈合，并能减少新生鼓膜的瘢痕形成[23]。因此常被用做鼓膜修复的支架材料，尤其是经化学修饰（如交联或酯化）的新型透明质酸材料。

2.3 合成材料

在合成材料中，已有聚甘油癸二酸酯（poly glycerol sebacate，PGS）、左旋聚乳酸（poly-L-lactic acid，PLLA）和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）被研究。PGS是一种可生物降解的合成多聚物，由聚甘油和癸二酸组成。PGS在栗鼠慢性鼓膜穿孔模型中显示其能促进细胞再生和新生血管形成[24]。该材料的优点包括可调控的生物降解性、易于合成、良好的生物相容性等。此外，最新研究表明，PLLA和PLGA具有良好的生物相容性和安全性，并且在大鼠鼓膜穿孔动物模型中可促进鼓膜愈合，愈合的鼓膜具有正常的三层显微结构[25，26]。

3 生物活性分子

鼓膜穿孔愈合是一个复杂的动态过程，是由细胞、细胞外基质和生物活性分子（如生长因子）之间相互作用和介导的过程。在慢性鼓膜穿孔的研究中，不同的生物活性分子均扮演着促进或延迟鼓膜愈合的角色。自从生长因子和其受体在鼓膜穿孔愈合中的作用被证实后，各类生长因子開始应用于动物实验和临床治疗中。

生长因子可广义上分为5种主要的家族：表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）和胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）。在鼓膜创伤愈合研究领域，EGF和FGF已被大量报道，而PDGF和TGF-β的研究比较有限，对于IGF目前仅有个别研究报道。

3.1 EGF家族

表皮生长因子家族由表皮生长因子（EGF）、转化生长因子α（transforming growth factor-α，TGF-α）、肝素结合生长因子（heparin-binding EGF-like growth factor，HB-EGF）、双向调节因子、细胞素和神经调节蛋白组成。EGF主要作用是促进细胞增殖，尤其是在鼓膜鳞状上皮细胞层[27]，它可在早期导致大量成纤维细胞和新生血管形成，伴随致密的结缔组织层形成[28]。重要的是，EGF在中耳内无耳蜗与前庭毒性[29]，因此在人体中是安全的。TGF-α与EGF在结构和功能上相似，但TGF-α已被证明在提高菌落分散中较EGF更有效[30]，而且是许多物质的最有效的促进因子。近期研究表明，在小鼠慢性鼓膜穿孔模型中，使用HB-EGF修复穿孔显示出较好的鼓膜愈合状态，并且听力恢复接近正常[31]。

3.2 FGF家族

在鼓膜中被研究较多的是碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），bFGF主要引起鼓膜上皮层和纤维层的增生，但对黏膜层影响较小[32]。使用bFGF后的前3 d能刺激成纤维细胞增殖以供上皮的移行[33，34]，在3 d后通过舒张血管加速穿孔愈合[35]。临床研究显示，在鼓膜穿孔第3天后（即创伤愈合的增殖期）使用bFGF对鼓膜修复有显著作用。该方法不仅可显著缩短鼓膜穿孔愈合时间，还可减少临床给药持续时间和与bFGF相关的副作用的发生[36]。最近的临床试验表明，每天持续小剂量bFGF[2～3滴/（次·d）]滴耳液能维持鼓膜潮湿环境，可促进鼓膜穿孔愈合，避免继发脓性耳漏，缩短愈合时间;相反，大剂量bFGF引起的鼓膜水样环境反而可能继发脓性耳漏，从而延长愈合时间[37]。近期临床试验表明，联用bFGF、明胶海绵和fibrin胶水治疗一组慢性鼓膜穿孔患者，其具有较高的成功率，且操作简单，不需要全身麻醉[38];然而，其中的作用机制和远期效果目前尚不清楚。在人类中，与炎症反应过程对比，bFGF似乎更主要作用于调节细胞增殖和迁移过程[39]。

3.3 PDGF家族

PDGF和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）组成一个高度受保护的PDGF/VEGF族。迄今为止，人们对鼓膜中的PDGF研究有限。在一项临床试验中，用含PDGF的纸质支架材料行局部治疗6周，与对照组比较并没有显示出任何优点[40]。VEGF能够增强血管通透性，促进新生血管的形成及血管内皮细胞的生长，是目前促进血管生成专属性最高、活性最强的因子[41]。对鼓膜中VEGF的研究表明VEGF是一种重要的促进鼓膜血管再生的调节剂[42]。

3.4 TGF-β家族

TGF-β家族包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，骨形态形成蛋白因子和激动素。TGF-β由创伤后活化的血小板释放，其对细胞增殖、分化及细胞外基质合成具有重要调节作用，在创伤愈合中具有多种生物学活性[43]。然而，TGF-β引起细胞外基质在组织创面处沉积，从而导致过度的瘢痕增生以及纤维化[44]。

4 细胞来源

用于组织工程鼓膜的细胞可从机体组织、细胞系或干细胞中获得。这些细胞在植入之前可以在体外被注入或者被混合成一定结构[45]。当前，细胞和生物支架联合应用于鼓膜穿孔治疗的相关研究还比较有限。

自体同源成纤维细胞种植于猪脱细胞ADM或豚鼠脱细胞硬脑膜后，组织再生加速并且新的细胞外基质在细胞种植组织中产生[46]。干细胞的作用也被扩展到鼓膜穿孔愈合中，经骨髓间充质干细胞治疗的鼓膜在第1周后炎症反应减弱，治疗2周后恢复鼓膜三层结构[47]。然而，当用于大鼠动物模型时，却没有促进鼓膜愈合。最新研究揭示人类鼓膜祖细胞位于鼓膜脐部、鼓环和锤骨柄处，表明这些部位可能是鼓膜创伤愈合过程中干细胞再生活跃的部位[48]。

5 小结和展望

尽管既往在证明鼓膜创伤愈合的影响因素上做了许多努力，但是，慢性鼓膜穿孔的发病机制目前尚未明确，选择何种生物活性分子和支架材料会产生最佳的鼓膜修复效果也亟待阐明。此外，缺乏一种可信的慢性鼓膜穿孔动物模型也是鼓膜创伤愈合研究领域的一个难点。无论细胞使用与否，支架材料和生物活性分子均是组织工程技术治疗鼓膜穿孔的重要因素，两者通过不同的机制来促使鼓膜创伤愈合，支架材料提供了基质支撑以引导鼓膜再生组织，而生物活性分子则促进鼓膜细胞增殖和迁移。虽然鼓膜组织工程学已取得了较大进步，但目前仍存在诸多挑战，我们期望该领域研究不断取得新的进步，并且鼓膜组织工程新技术能够在临床中得到应用。

[参考文献]

[1] 宋勇莉，陈俊，温立婷，等. 继发性获得性胆脂瘤临床分析[J]. 临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2018，32（18）：1383-1386.

[2] 金小. 54例慢性重症化脓性中耳炎的临床治疗体会[J].世界最新医学信息文摘，2017，17（13）：84-84.

[3] Villar-Fernandez MA，Lopez-Escamez JA. Outlook for Tissue Engineering of the Tympanic Membrane[J]. Audiol Res，2015，5（1）：117.

[4] OConnor K，Tam M，Blevins N，et al. Tympanic membrane collagen fibers：a key to high frequency sound conduction[J]. Laryngoscope，2008，118（3）：483-490.

[5] Clark RA，Ghosh K，Tonnesen MG. Tissue engineering for cutaneous wounds[J]. Invest Dermatol，2007，127（5）：1018-1029.

[6] Nelson CM，Bissell MJ. Of extracellular matrix，scaffolds，and signaling：tissue architecture regulates development， homeostasis，and cancer[J]. Annu Rev Cell Dev Biol，2006， 22：287-309.

[7] Youssef AM. Use of acellular human dermal allograft in tympanoplasty[J]. Laryngoscope，1999，109（11）：1832-1833.

[8] Mc Feely W，Bojrab D，Kartush J. Tympanic membrane perforation repair using AlloDrem[J]. Otolaryngol Head Neck Surg，2000，123：17-21.

[9] Downey TJ，Champeaux AL，Silva AB. AlloDerm tympanoplasty of tympanic membrane perforations[J]. Am J Otolaryngol，2003，24（1）：6-13.

[10] Farahani F，Karimi Yazdi A，Ghasemi M，et al. Results of Acellular Dermis Matrix graft used for Tympanoplasty in Guinea pig model[J]. Iran J Otorhinolaryngol，2015，27（79）：95-100.

[11] 亓曉茗，吕春雷，赵月菊. 脱细胞异体组织补片修补外伤性鼓膜穿孔[J].实用医药杂志，2011，28（4）：303-304.

[12] Spiegel JH，Kessler JL. Tympanic membrane perforation repair with acellular porcine submucosa[J]. Otol Neurotol，2005，26（4）：563-566.

[13] Parekh A，Mantle B，Banks J，et al. Repair of the tympanic membrane with urinary bladder matrix[J]. Laryngoscope，2009，119（6）：1206-1213.

[14] Schwarz D，Pazen D，Gosz K，et al. Acoustic Properties of Collagenous Matrices of Xenogenic Origin for Tympanic Membrane Reconstruction[J]. Otology & Neurotology，2016， 37（6）：692-697.

[15] Agarwal S，Wendorff JH，Greiner A. Progress in the field of electrospinning for tissue engineering applications[J]. Adv Mater，2009， 21（32-33）：3343-3351.

[16] Shen Y，Teh BM，Friedland PL，et al. To pack or not to pack？ A contemporary review of middle ear packing agents[J]. Laryngoscope， 2011，121（5）：1040-1048.

[17] Lou ZC，He JG. A randomised controlled trial comparing spontaneous healing， gelfoam patching and edge-approximation plus gelfoam patching in traumatic tympanic membrane perforation with inverted or everted edges[J]. Clin Otolaryngol，2011，36（3）：221-226.

[18] Shen Y，Redmond SL，Teh BM，et al. Scaffolds for tympanic membrane regeneration in rats[J]. Tissue Eng Part A，2013，19（5-6）： 657-668.

[19] Shen Y，Redmond SL，Teh BM，et al. Tympanic membrane repair using silk fibroin and acellular collagen scaffolds[J]. Laryngoscope， 2013，123（8）：1976-1982.

[20] Ahmed S，Annu，Ali A，et al. A review on chitosan centred scaffolds and their applications in tissue engineering[J].Biological Macromolecules，2018，116：849-862.

[21] Kim J，Kim SW，Choi SJ，et al. A healing method of tympanic membrane perforations using three-dimensional porous chitosan scaffolds[J]. Tissue Eng Part A，2011，17（21-22）：2763-2772.

[22] Weber DE，Semaan MT，Wasman JK，et al. Tissue engineered calcium alginate patches in the repair of chronic chinchilla tympanic membrane perforations[J]. Laryngoscope，2006，116（5）：700-704.

[23] Teh BM，Shen Y，Friedland PL，et al. A review on the use of hyaluronic acid in tympanic membrane wound healing[J]. Expert Opin Biol Ther，2012，12（1）：23-36.

[24] Wieland AM，Sundback CA，Hart A，et al. Poly（glycerol sebacate）-engineered plugs to repair chronic tympanic membrane perforations in a chinchilla model[J]. Otolaryngol Head NeckSurg，2010，143（1）：127-133.

[25] Immich APS，Pennacchi PC，Naves AF，et al. Improved tympanic membrane regeneration after myringoplastic surgery using an artificial biograft[J]. Materials Science and Engineering，2017，73：48-58.

[26] 崔西棟，鲁飞，赵霞，等. 可降解聚酯材料行鼓膜修补的实验研究[J]. 临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2010，24（16）：755-756.

[27] Amoils CP，Jackler RK，Lustig LR. Repair of chronic tympanic membrane perforations using epidermal growth factor[J]. Otolaryngol Head Neck Surg，1992，107（5）：669-683.

[28] Lee AJ，Jackler RK，Kato BM，et al. Repair of chronic tympanic membrane perforations using epidermal growth factor：progress toward clinical application[J]. Am J Otol，1994，15（1）：10-18.

[29] 葛惊涛. 表皮生长因子对鼓膜穿孔的愈合作用及对内耳功能的影响[J]. 现代医药卫生，2016，32（6）：914-916.

[30] Cha D，OBrien P，OToole EA，et al. Enhanced modulation of keratinocyte motility by transforming growth factor-α（TGF-α） relative to epidermal growth factor（EGF）[J]. Invest Dermatol，1996，106（4）：590-597.

[31] Santa Maria PL，Gottlieb P，Santa Maria C，et al. Functional Outcomes of Heparin-Binding Epidermal Growth Factor-Like Growth Factor for Regeneration of Chronic Tympanic Membrane Perforations in Mice[J]. Tissue Eng PartA，2017，23（9-10）：436-444.

[32] Kato M，Jackler RK. Repair of chronic tympanic membrane perforations with fibroblast growth factor[J]. Otolaryngol Head Neck Surg，1996，115（6）：538-547.

[33] Fina M，Bresnick S，Baird A，et al. Improved healing of tympanic membrane perforations with basic fibroblast growth factor[J]. Growth Factors，1991，5（4）：265-272.

[34] Fina M，Baird A，Ryan A. Direct application of basic fibroblast growth factor improves tympanic membrane perforation healing[J]. Laryngoscope，1993，103（7）：804-809.

[35] Mondain M，Ryan A. Effect of basic fibroblast growth factor on normal tympanic membrane[J]. Am J Otolaryngol，1994，15（5）：344-350.

[36] Zhengcai Lou，Yubizhuo Wang. Evaluation of the optimum time for direct application of fibroblast growth factor to human traumatic tympanic membrane perforations[J].Growth Factors，2015，33（2）：65-70.

[37] 楼正才，陈华英，吴小洪. 不同剂量碱性成纤维细胞生长因子治疗鼓膜创伤性穿孔的疗效比较[J].中国全科医学，2016，19（6）：706-709.

[38] Omae K，Kanemaru S，Nakatani E，et al. Regenerative treatment for tympanic membrane perforation using gelatin sponge with basic fibroblast growth factor[J]. Auris Nasus Larynx，2017，44（6）：664-671.

[39] Lou Z，Tang Y，Wu X. Analysis of the effectiveness of basic fibroblast growth factor treatment on traumatic perforation of the tympanic membrane at different time points[J]. Am J Otolaryngol， 2011，33（2）：244-249.

[40] Roosli C，von Buren T，Gassmann NB，et al. The impact of platelet-derived growth factor on closure of chronic tympanic membrane perforations：a randomized， double-blind， placebo-controlled study[J]. Otol Neurotol，2011， 32（8）：1224-1229.

[41] 唐乾利，郭滿，吴标良. 血管内皮生长因子的研究现状与进展[J]. 中国烧伤创疡杂志，2017，29（2）：77-87.

[42] Cho KS，Lee DG，Shin DH，et al. The importance of vascular endothelial growth factor in the healing of acute tympanic membrane perforation[J]. Am J Otolaryngol，2009，31（5）：309-314.

[43] 刘志贵，王晓旭，谭文甫. TGF-β在膝部韧带愈合中的研究进展[J]. 现代医药卫生，2017，33（3）：387-390.

[44] Border WA，Ruoslahti E. Transforming growth factor-beta in disease：the dark side of tissue repair[J]. J Clin Invest，1992，90（1）：1-7.

[45] Knight MAF，Evans GRD. Tissue engineering：progress and challenges[J]. Plast Reconstr Surg，2004，114（2）：26e-37e.

[46] Deng Z，Wu J，Qiu J，et al. Comparison of porcine acellular dermis and dura mater as natural scaffolds for bioengineering tympanic membranes[J]. Tissue Eng Part A，2009，15（12）：3729-3739.

[47] Goncalves S，Bas E，Langston M，et al. Histologic changes of mesenchymal stem cell repair of tympanic membrane perforation[J]. Acta Otolaryngol.，2017，137（4）：411-416.

[48] Liew LJ，Chen LQ，Wang AY，et al. Tympanic membrane derived stem cell-like cultures for tissue regeneration[J]. Stem Cells Dev，2018， 27（10）：649-657.