苗药黑骨藤不同极性提取部位急性毒性及抗氧化研究

金文渊 杨欣 刘育辰 刘刚

摘要[目的]对黑骨藤不同极性部位进行急性毒性试验及抗氧化研究，确定其临床用药安全性及活性部位。[方法]急性经口毒性试验采用SD（180～220g）大鼠，连续灌胃给药7d（9.75g/kg）后，测定血清中的肝功能和肾功能等相关指标，观察其肝脏、肾脏毒性反应，采用ABTS（agreementofbasictelecommunicationsservices）法测定肝脏中的总抗氧化能力。[结果]黑骨藤不同极性部位给药7d后，大鼠未出现死亡，石油醚部位、氯仿部位、醋酸乙酯部位、正丁醇部位组对肝脏和肾脏生化指标均无显著性影响（P>0.05），水部位组大鼠血清中的ALP和BUN显著升高（P<0.05）。[结论]黑骨藤的不同极性部位中的石油醚部位、氯仿部位、醋酸乙酯部位、正丁醇部位未出现毒性反应，水部位中的ALP和BUN升高，可能表现出微低毒性。氯仿部位和正丁醇部位表现出较强的抗氧化能力。

关键词黑骨藤;急性毒性;肝损伤;肾损伤;抗氧化能力

中图分类号R284文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）01-0186-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.055

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

机体要通过一些抗氧化剂防御系统使自由基的产生与消除维持在一个生理性低水平。一旦自由基过多或抗氧化体系出现故障，自由基的产生与消除就会失去平衡，而过多自由基诱导的氧化反应将会引起膜损伤，从而导致核酸代谢产生误差，进而引发动脉粥样硬化、癌症、心脑血管疾病、炎症、糖尿病等多种疾病。因此通过体外摄入一些抗氧化剂或自由基清除剂来维持机体内自由基代谢的平衡对于预防疾病的发生和人体的健康具有十分重要的意义。目前，中药中的抗氧化性成分很多，如黄酮类、多酚类、多糖类等，这些都属于植物类抗氧化性成分。这些抗氧化剂具有较强的还原性，在人体内可以清除人体内不利的自由基，这些抗氧剂可以保护机体免受于这些自由基的损害。近年来，医药行业、保健食品行业，越来越关注从中药中提取分离和纯化抗氧化活性成分，這些应用研究为开发植物来源抗氧剂奠定了良好的基础[1-3]。

黑骨藤药材资源丰富，具有悠久的临床应用和食用历史，生物活性十分广泛，为贵州常用治疗风湿、类风湿疾病及颈肩臂腰腿疼痛的苗药。目前已开展大量的化学成分和药理作用研究，并取得了诸多成果。黑骨藤的主要功效活血通经、祛风湿，治跌打损伤、风湿痹疼、口腔炎、咽喉炎、乳腺炎等。但是黑骨藤超量或误服大量则引起中毒，轻则恶心、呕吐、晕厥，严重时出现心律失常，甚则危及生命。黑骨藤不同极性部位目前缺少其毒性及抗氧化活性的相关资料[4-6]。急性毒性试验（acutetoxicitytest）是新药研发和药物毒理不可以缺少的药理试验，对阐明药物的毒性作用、了解其毒性靶器官具有指导作用。笔者通过SD大鼠经口接受单剂量的黑骨藤不同极性部位混悬液，观察大鼠在短期内出现的异常反应以及各主要脏器有无异常改变，探讨其在生物体内应用的安全性，为进一步研究、开发新药提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物。SD大鼠，雌性，体重180～220g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK-（湘）2014-0011。

1.1.2

试剂及药物配制。药材采自贵州省贵阳市开阳县，经贵阳中医学院药学院魏升华教授鉴定为萝藦科杠柳属黑骨藤（PerplocaforrestiiSchltr.），药材样品保存于贵阳中医学院植物化学实验室。甘油三酯（TG）、胆固醇（CHO）、总蛋白（TP）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、葡萄糖（GLU）、乳酸脱氢酶（LDH）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）、碱性磷酸酶（ALP）、白蛋白（ALB）试剂盒均购自北京豪迈生物工程有限公司;总抗氧化能力试剂盒（A015-2），南京建成生物科技有限公司，批号20170705。

1.1.3仪器。yc-ro/40纯水器（四川怡创科技有限公司）;Varioskanflash酶标仪（ThermofisherScientific）;Allegrax-30rcentrifuge4℃离心机（Beckmancoulter）;Forma8800超低温冰箱（ThermofisherScientific）;Puzs-300全自动生化仪（北京普朗新技术有限公司）;MettlerToledo电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。

1.2方法

1.2.1供试品制备。黑骨藤药材阴干，切段，粉碎成粗粉，用8倍量70%乙醇加热回流提取3次，每次3h，趁热过滤，合并滤液减压浓缩至稠膏状，得醇提物，用适量蒸馏水进行分散，依次用石油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂，得石油醚部位、氯仿部位、醋酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。

1.2.2分组及给药。雌性SD大鼠42只（180～220g），实验动物适应环境后随机分为6组，即空白对照组、石油醚部位组、氯仿部位组、醋酸乙酯部位组、正丁醇部位组、水部位组，每组各7只。灌胃给药前禁食12h，不禁水。各组给药剂量按人临床用量的65倍计算，各组给药剂量即为9.75g/kg，用0.5%CMC-Na（羧甲基纤维素钠）配制成浓度为0.4875g/mL的黑骨藤各部位混悬液，空白对照组灌胃等量0.5%CMC-Na。所有大鼠在灌胃给药后进行常规饲养，自由摄食及饮水，连续给药7d。各组饲养过程中保持室温度、湿度等均衡，自由进食饮水[7-8]。

1.2.3试验取材。试验取材前大鼠禁食12h，不禁水，次日上午SD大鼠通过腹腔内注射1%戊巴比妥钠麻醉（5mL/kg体重），迅速打开腹腔，腹主动脉取血，用于生化指标检测。取出心、肝、脾、肺、肾、脑分别用锡箔纸包好，然后转移至-80℃冰箱保存备用。每个试验指标选用同一部位的组织进行。

1.2.4大鼠血清生化指标。SD大鼠腹主动脉取血之后静置30min，3500r/min离心15min，取1mL上清液置2mL离心管中。采用Puzs-300全自动生化仪检测血清生化指标，具体指标包括AST、ALP、ALT、BUN、TP、CRE、ALB、GLU、TG、CHO、LDH[9]。

1.2.5总抗氧化能力检测。准确称取肝脏组织重量，按重量（g）∶体积（mL）=1∶4的比例，加入4倍体积的生理盐水或者磷酸缓冲盐溶液（PBS），冰水浴条件下机械匀浆，以充分破碎细胞并释放其中的抗氧化物，4℃，12000r/min，离心5min，取上清测定。取10mmol/LTrolox标准液用双蒸水稀释成0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mmol/L绘制标准曲线。在405nm采用酶标仪读取各孔OD（光密度）值[8-9]。

1.3数据统计分析

采用SPSS13.0软件对试验数据进行分析，计量数据均以±SD表示，采用单因素方差分析，结果以P<0.05为显著差异，具有统计学意义。

2结果与分析

2.1黑骨藤不同极性提取部位对大鼠体温和体重的影响

从表1～2可看出，给药7d后，黑骨藤有效部位体温和体重都有增高，与给药前进行比较，第4天和第6天体重和体温呈增高趋势，具有显著差异（P<0.05）。

2.2血液生化指标检测结果

2.2.1肝脏功能。试验结果（表3）显示，与空白对照组相比，石油醚部位组、氯仿部位组、醋酸乙酯部位组、正丁醇部位组的ALT、AST、ALP无显著性差异（P>0.05），水部位组中的ALP升高，差异显著（P<0.05）。蛋白合成主要在肝脏中完成，肝脏不仅能合成自身蛋白，还能分泌90%以上的血浆蛋白质。通过试验结果分析，黑骨藤不同极性部位中石油醚部位组、氯仿部位组、醋酸乙酯部位组、正丁醇部位组、水部位组与空白组比较，大鼠ALB、TP均属于正常范围，没有发生显著变化。

2.2.2肾功能。肾脏最主要的功能是维持体液平衡及体内酸碱平衡。肾脏通过肾小球的滤过、肾小管的重吸收及分泌功能，排出体内多余的水分，调节酸碱平衡，维持内环境的稳定。试验结果（表3）表明，与空白对照组比较，石油醚部位组、氯仿部位组、醋酸乙酯部位组、正丁醇部位组血清中的BUN、CRE无显著性差异（P>0.05），水部位组血清中的BUN升高，具有显著差异（P<0.05）。

2.2.3脂类代谢。血液中的胆固醇大多数都能与脂肪酸结合，仅有少数的以游离状态存在的胆固醇作为细胞膜的成分维持细胞的形态和功能，胆固醇测定对脂肪代谢异常有很大的帮助。试验结果（表3）显示，与空白对照组相比，石油醚部位组、氯仿部位组、醋酸乙酯部位组、正丁醇部位组、水部位组的TG无显著性差异（P>0.05）。

2.2.4糖代谢。由表3可知，与空白对照组相比，氯仿部位组、醋酸乙酯部位组和水部位组的GLU无显著性差异（P>0.05）;石油醚部位组、正丁醇部位组的GLU明显降低，具有显著差异（P<0.01）。

2.2.5能量代谢。乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase，LDH）分布广泛，机体组织中几乎都存在，在糖代谢过程发挥重要作用。试验结果（表3）显示，与空白对照组相比，石油醚部位组、氯仿部位组、醋酸乙酯部位组和水部位组的LDH有降低趋势，但是无显著性差异（P>0.05）;正丁醇部位组能显著降低LDH（P<0.05）。

2.3总抗氧化能力

以标准品OD值为横坐标、各OD值对应的标准品浓度为纵坐标绘制标准曲线，用SPSS得出曲线公式，把样本测定管测得的OD代入计算公式，求得结果[10]。标准曲线方程为Y=-0.932X+1.2216。与空白对照组比较，石油醚部位组、氯仿部位组、醋酸乙酯部位组、正丁醇部位组和水部位组的TOC明显升高，具有显著性差异（P<0.05）。详见表3。

3结论与讨论

动物生长发育情况、营养状况、生理状态及健康情况主要由动物外观、体温、体重等一般指标可反映，若生长过程中受到毒物、外界环境等因素的影响，可以通过生长发育和外观反映。该研究采用SD大鼠连续灌胃给药7d，用药剂量相当于人临床用药65倍，发现黑骨藤有效部位体温和体重呈增高趋势，第6天体重和体温明显增高，可能由于黑骨藤是温性中药，所以体温和体重增高。血液生化能准确地反映机体的损伤程度，是临床和试验研究比较常用的方法，黑骨藤有效部位在TG、AST、ALT、ALP、GLU、BUN等生化指標中存在一定的差异性。AST、ALT、ALP主要存在肝脏中，作为判断肝脏损伤的经典指标[10-12]。TG主要在肝脏发生代谢反应，可以氧化供能，也可以分泌进入血液，被其他组织利用，当肝脏损伤时，血中TG水平升高。黑骨藤的有效部位水相造成血清ALP升高，使胆汁排泄受到抑制，但血清中的TG未表现出增高趋势，可能由轻微毒性。综上所述，黑骨藤水相部分有一定的毒性，但是比较小。服用剂量要适量，不能长时间服用。葡萄糖（GLU）在机体中以碳水化合物的形式被机体直接吸收利用，发生氧化反应，为机体供应活动所需要的能量。黑骨藤有效部位中的石油醚和正丁醇使血清中的GLU显著降低，可能使糖耐量受损或糖代谢异常导致，不宜长期大剂量服用。

目前，类风湿关节炎给人类健康造成了严重威胁，人们逐渐开始重视。类风湿关节炎（rheumatoidarthritis，RA）是一种以关节炎症和滑膜组织增生为特征的慢性自身免疫性疾病，可引起大量细胞浸润和炎症介质的过度产生，最终导致软骨和骨的破坏，研究表明，黑骨藤具有很好的抗类风湿关节炎作用[13]。机体作为一个整体，存在多种抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶等，主要功能是清除体内产生的各种活性氧，防止产生活性氧诱导的氧化压力。总抗氧化能力主要由抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的总的水平体现。抗氧化功能评价方法主要在体内和体外进行评价。体内抗氧化方法主要采用动物模型，研究证明，人体的抗氧化系统和免疫系统具有相似性，是比较完善和复杂功能的系统，机体抗氧化的能力越强，能有效抵抗外界侵害越强[14-15]。黑骨藤有效部位石油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇、水部位都具有一定的抗氧化能力，有待于进一步进行活性研究，希望能为临床提供一个抗类风湿关节炎的新药。

参考文献

[1]杨玲，许速.氧化应激与疾病发生的相关性[J].西南国防医药，2012，22（11）：1268-1270.

[2]SACHIDANANDAMK，FAGANSC，ERGULA.Oxidativestressandcardiovasculardisease：Antioxidantsandunresolvedissues[J].CardiovascDrugRev，2005，23（2）：115-132.

[3]李洋，马文平，倪志婧.宁夏枸杞体外抗氧化机理研究[J].食品科学，2014，35（1）：79-84.

[4]刘明，刘刚，刘育辰，等.黑骨藤镇痛抗炎作用活性部位筛选[J].药物评价研究，2014，37（4）：322-325.

[5]张令令，肖智勇，马渊，等.苗药黑骨藤多糖部位HGT-5A的细胞免疫抑制作用及其可能的活性成分[J].中国药理学与毒理学杂志，2011，25（6）：538-542.

[6]陈芳，汪毅.苗药黑骨藤的研究及开发应用[J].中国民族民间医药，2010，19（1）：6-7.

[7]王秋红，杨欣，王蒙，等.黄芩与黄柏协同保护黄药子致肝毒性的实验研究[J].中国中药杂志，2016，41（5）：898-903.

[8]曹亮亮，王文晓，张丽，等.基于“有故无殒”思想的醋甘遂毒性研究[J].中国中药杂志，2015，40（16）：3249-3255.

[9]侯甲福，郑著家，刘世娟，等.锦花清热胶囊对动物急性及长期毒性研究[J].毒理学杂志，2016，30（2）：172-173.

[10]赵子婧，巩政，史少泽，等.补骨脂及其与甘草配伍单次给药大鼠的毒代动力学及肝肾毒性初探[J].中国中药杂志，2015，40（11）：2221-2226.

[11]程生辉，张妍妍，李会芳，等.基于黄疸模型大鼠的栀子苷急性肝肾毒性研究[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（4）：174-178.

[12]郭晓，王萌，朱彦，等.中药肾毒性机制研究现状及评价方法研究进展[J].中草药，2015，46（23）：3581-3591.

[13]CHENL，LIJS，KEX，etal.ThetherapeuticeffectsofPeriplocaforrestiiSchltr.StemextractsoncollageninducedarthritisbyinhibitingtheactivationofSrc/NFκBsignalingpathwayinrats[J].JEthnopharmacology，2017，202：12-19.

[14]李維熙，李怡芳，何蓉蓉.儿茶素类化合物抗氧化评价方法及作用机制的研究现状[J].中药新药与临床药理，2016，27（2）：295-303.

[15]陈凡，马善丽，许颖，等.超高压处理对豆乳总多酚、类黄酮含量及其抗氧化性的影响[J].大豆科学，2011，30（2）：310-313.