结缔组织生长因子对POAG患者Tenon囊成纤维细胞的影响

陈小霞，曹 阳

0引言

滤过手术是目前治疗原发性开角型青光眼(primary open-angle glaucoma，POAG)的经典手术方式，滤过泡瘢痕化是抗青光眼滤过术失败的主要原因，主要是由于Tenon囊成纤维细胞(Tenon’s capsule fibroblasts, Tfb)在多种生长因子(如TGF-β家族)的作用下增殖、移行和发生表型转化，转化为肌成纤维细胞，其特征性变化是胞浆内α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)大量增加，细胞外基质过度合成蓄积，最终导致滤过区瘢痕化[1-3]。Esson等[4]研究发现兔抗青光眼滤过术后结膜滤过泡组织中存在TGF-β2和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)的高表达，提示在滤过泡瘢痕形成过程中CTGF 可能起作用。因此，我们通过体外实验研究CTGF对POAG患者Tfb细胞增殖、移行和转化的影响，以进一步探讨CTGF在滤过泡瘢痕化中的可能作用。

1材料和方法

1.1材料POAG患者Tenon囊组织:经华中科技大学同济医学院附属协和医院伦理委员会审核通过，和拟在本院眼科接受小梁切除术的POAG患者同意，其Tenon囊组织取自小梁切除术中。 主要试剂: DMEM-F12培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(fetalbovine serum, FBS) (中国杭州四季青生物工程材料研究所)；0.25%胰蛋白酶(美国Ameresco公司)；Trizol、逆转录聚合酶链反应试剂盒(美国Invitrogen公司)；α-SMA及β-actin引物(中国武汉众一生物技术有限公司合成)；噻唑蓝(3, 4, 5-dimethyliazol-2, 5diphenyltetrazolium bromide, MTT)(美国Sigma公司)；小鼠抗人α-SMA多克隆抗体、免疫组化(SABC法)即用型试剂盒(山羊IgG)和DAB试剂盒(武汉意德生物技术有限公司)；人重组CTGF蛋白(美国Peprotech公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养利用POAG患者的Tenon囊组织行组织块法培养Tfb细胞，接种后约1～2d，细胞开始贴壁生长，繁殖较快，呈放射状或旋涡状走行。光镜下检查呈典型的梭形，胞体狭长(图1)。经免疫组化染色，α-SMA阳性成纤维细胞表现为胞浆呈棕黄色染色(图2)。待细胞生长至融合状态，用0.25%胰蛋白酶消化、传代，实验使用3～6代细胞。

1.2.2 MTT法检测CTGF对POAG患者Tfb细胞增殖的影响取对数生长期的细胞，用含10% FBS的DMEM-F12培养液调细胞密度至5×104/mL，接种于96孔板中，每孔200μL。在5%CO2培养箱37℃下培养24h后，换用无血清的培养液培养24h，使细胞同步化。实验分为两组：(1)对照组：加入含0.5%FBS的DMEM-F12培养液；(2)CTGF处理组：加入终浓度为1.0、10.0、100.0ng/mL CTGF的培养液。每组设5个复孔，作用48h后，每孔加入5g/L的MTT 20μL，继续培养4h，吸弃培养液，每孔加入150μL的二甲基亚砜，振荡10min，使结晶物充分溶解，应用酶联免疫检测仪测定各孔490nm吸光度(A)值。

图1 正常Tfb细胞胞体狭长呈梭形(×100)。

图2 α-SMA阳性成纤维细胞表现为胞浆呈棕黄色染色(×400)。

1.2.3细胞划痕法检测CTGF对POAG患者Tfb细胞移行的影响细胞接种于12孔培养板中，细胞培养时间和同步化同前，用无菌的1 000μL的Tip头造成条形细胞缺损区，PBS漂洗3次以去除悬浮细胞，细胞处理同前，继续培养24h，于倒置相差显微镜下观察细胞移行情况，随机选取每孔5个视野(100倍)并照相计数越过划线移行的细胞个数。

1.2.4 RT-PCR检测CTGF对POAG患者Tfb细胞中α-SMA mRNA表达的影响细胞处理同前，24h后收集对照组和实验组细胞，Trizol试剂提取细胞总RNA，溶于无RNase的水中，紫外分光光度计测定A260/A280的比值在1.8～2.0之间。α-SMA引物上游5’-ACTACTGCTGAGCGTGAGATTG-3’，下游5’-CATGATGCTGTTGTAGGTGGTT-3’，扩增片段长度为246bp；β-actin上游5’-AACTGGAACGGTGAAGGTGACAGCA-3’，下游5’-CCACTCCCAGGGAGACCAAAAGCCT-3’，引物扩增片段长度为380bp。PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃30s，72℃60s，35次循环后，72℃延伸7min，取2.5μL PCR产物进行20g/L琼脂糖凝胶电泳40min，紫外灯下照相，用图像分析处理系统(UVI公司)进行灰度扫描。并以β-actin为内参照，校正作相对量分析，数值以两者之积分吸光度的比值表示。

1.2.5免疫细胞化学染色法检测POAG患者Tfb细胞α-SMA蛋白表达的作用制备Tfb细胞悬液，调细胞浓度至5×105/mL，接种于放置消毒盖玻片的12孔板中，细胞培养时间和同步化同前，细胞处理同前。24h后取出盖玻片，新鲜配制的4%多聚甲醛固定15min，采用SABC试剂盒进行α-SMA蛋白免疫组化染色，应用德国DMR+Q550病理图像免疫组化测量系统，对α-SMA蛋白表达进行图像分析。每张切片随机选取5个视野输入计算机，测量阳性细胞的平均光密度值。

图3 不同浓度CTGF对POAG患者Tfb细胞移行的影响(×100) A:对照组；B：1.0ng/mL CTGF组；C:10.0ng/mL CTGF组；D：100.0ng/mL CTGF组。

统计学分析：采用SPSS15.0软件包处理数据，所有实验均独立重复3次，数据用均数±标准差表示，首先采用单因素方差分析进行多组间的比较，若存在差异，可进一步采用LSD-t检验进行组间两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1不同浓度CTGF对POAG患者Tfb细胞增殖的影响在实验条件下，MTT法测得1.0、10.0、100.0ng/mL CTGF处理组的A值分别是0.436±0.009、0.643±0.009、0.679±0.006, 对照组为0.423±0.156。四组间差异有统计学意义(F=75.624,P=0.010)，1.0ng/mL CTGF组与对照组间差异无统计学意义(t=5.482,P=0.297)，10.0、100.0ng/mL CTGF组与对照组间差异有统计学意义(t=7.638,P=0.005；t=8.642,P=0.010),1.0ng/mL分别与10.0、100.0ng/mL CTGF组间差异有统计学意义(t=9.183,P=0.009；t=8.326,P=0.010),10.0ng/mL与100.0ng/mL CTGF组间差异有统计学意义(t=9.486,P=0.016)。

2.2不同浓度CTGF对POAG患者Tfb细胞移行的影响在划线后24h, 可见对照组和处理组均有成纤维细胞向空白区移行生长,1.0、10.0、100.0ng/mL CTGF处理组的细胞移行数分别为34.600±3.507、70.400±2.074、80.000±2.915个，对照组为31.000±3.536个。四组间差异有统计学意义(F=69.835,P=0.010)，1.0ng/mL CTGF组与对照组差异无统计学意义(t=4.586,P=0.283)，10.0、100.0ng/mL CTGF组与对照组相比移行细胞数差异有统计学意义(t=10.132,P=0.005；t=8.649,P=0.010)。1.0ng/mL分别与10.0、100.0ng/mL CTGF组间相比移行细胞数差异有统计学意义(t=9.163,P=0.008；t=10.961,P=0.012)，10.0ng/mL与100.0ng/mL CTGF组间相比移行细胞数差异有统计学意义(t=10.364,P=0.010)。

图4 POAG患者Tfb细胞α-SMA和β-actin RT-PR凝胶电泳结果 M:Marker；1：对照组；2：1.0ng/mL CTGF组；3：10.0ng/mL CTGF组；4：100.0ng/mL CTGF组。

2.3不同浓度CTGF对POAG患者Tfb细胞α-SMA mRNA表达的影响RT-PCR产物电泳结果提示，细胞处理24h后，1.0、10.0、100.0ng/mL的浓度CTGF处理组α-SMA/β-actin条带吸光度比值分别为0.873±0.161、1.213±0.312、1.352±0.376,对照组是0.851±0.158。四组间差异有统计学意义(F=66.423,P=0.002),1.0ng/mL CTGF处理组α-SMA/β-actin条带吸光度比值与对照组相比，差异无统计学意义(t=3.123,P=0.243)，10.0、100.0ng/mL CTGF处理组与对照组α-SMA/β-actin比值相比，差异有统计学意义(t=6.543,P=0.001；t=7.616,P=0.001)。1.0ng/mL分别与10.0、100.0ng/mL CTGF处理组α-SMA/β-actin比值相比，差异有统计学意义(t=7.165,P=0.003；t=8.642,P=0.010),10.0ng/mL与100.0ng/mL CTGF处理组α-SMA/β-actin比值相比，差异有统计学意义(t=8.165,P=0.001)。

2.4不同浓度CTGF对POAG患者Tfb细胞α-SMA蛋白表达的影响α-SMA阳性成纤维细胞表现为胞浆呈棕黄色染色，CTGF诱导Tfb细胞24h后，1.0、10.0、100.0ng/mL CTGF处理组阳性细胞的平均光密度值分别是0.110±0.026、0.141±0.017、0.175±0.027，对照组是0.108±0.020。四组间差异有统计学意义(F=61.397,P=0.002)，1.0ng/mL CTGF组与对照组间差异无统计学意义(t=4.412,P=0.136)，10.0、100.0ng/mL CTGF实验组阳性细胞的平均光密度值与对照组间差异有统计学意义(t=5.136,P=0.000；t=4.954,P=0.001)。1.0ng/mL分别与10.0、100.0ng/mL CTGF实验组阳性细胞的平均光密度值相比差异有统计学意义(t=7.613,P=0.004；t=6.108,P=0.006),10.0ng/mL与100.0ng/mL CTGF实验组相比差异有统计学意义(t=6.489,P=0.005)。

3讨论

POAG是我国主要致盲眼病之一，滤过手术是目前抗青光眼手术的主要方式。滤过泡瘢痕形成是抗青光眼滤过术失败的主要原因，主要是由于Tfb在多种细胞因子(如TGF-β家族)的作用下增殖、移行和发生表型转化，转化为肌成纤维细胞[1-3]，免疫组化研究显示，肌成纤维细胞含有肌动蛋白和肌球蛋白，尤其是高表达α-SMA，α-SMA是目前公认的肌成纤维细胞标志物。肌成纤维细胞分泌的细胞外基质和多种生物活性因子参与组织修复，若肌成纤维细胞持续存在则可形成组织纤维化，并发生瘢痕收缩，最终导致滤过区瘢痕化[5]。

众所周知，TGF-β被认为是促进纤维化发展最重要的生长因子，在青光眼滤过泡瘢痕化形成中亦起着重要作用。朱晓燕等[6]发现TGF-β可诱导成纤维细胞分化，一定程度上其作用呈质量浓度依赖性和时间依赖性，且细胞收缩力随质量浓度的增加而增强，可能是青光眼滤过术后滤过通道建立失败的重要机制。动物实验研究显示，TGF-β抗体(CAT-152)能够提高青光眼术后功能滤过泡的形成率、延长滤泡存在时间[7]。

图5 不同浓度CTGF作用POAG患者Tfb中α-SMA染色情况(SABC×400) A:对照组；B：1.0ng/mL CTGF组；C:10.0ng/mL CTGF组；D：100.0ng/mL CTGF组。

TGF-β除了诱导如成纤维细胞等的间质细胞增生与分化，促进细胞外基质(ECM)的形成、加快伤口愈合；还能够抑制包括上皮细胞、内皮细胞及淋巴细胞等的增殖与分化；抑制免疫反应、防止肿瘤的发生和恶变。为了避免因抑制TGF-β可能引起的不良反应，需要寻求特异性更强的抗纤维化性治疗靶点。

CTGF是一种36～38kD的富含半胱氨酸的分泌型糖基化蛋白，由349个氨基酸组成。人的CTGF是1991年Bradham等[8]从培养的人脐静脉内皮细胞的基质中发现的，CTGF是高度保守的即刻早期基因CCN家族的成员之一，其生物学效应包括刺激细胞增生、迁移，细胞外基质的生成、新生血管形成、细胞黏附、细胞凋亡、细胞表型转化等[8-10]。作为TGF-β的下游信号分子，CTGF的作用比较单一，并且介导TGF-β的促纤维化作用时，作用范围往往局限在结缔组织的间质细胞中，对CTGF表达的靶向性阻断可能会成为组织和器官抗纤维化治疗的关键。

Hao等[11]采用CTGF siRNA 重组慢病毒抑制CTGF在肝星状细胞和CCl4诱导的肝纤维化大鼠的表达后发现：可明显地抑制肝星状细胞的活化和增殖，降低细胞外基质合成。而且CTGF shRNA重组体能明显抑制肝星状细胞的增殖和黏附能力[12]。表明CTGF在肝纤维化发病中起关键作用，抑制CTGF可能是治疗肝纤维化的有效方法。张树华等[13]应用腹腔注射链脲佐菌素的方法诱导糖尿病大鼠模型，相应时间点采用免疫组织化学法检测肾脏CTGF含量，同时进行肾脏病理检测并进行组间比较来探讨糖尿病大鼠肾脏纤维化与CTGF表达的关系得出，糖尿病大鼠CTGF的高表达，可能与肾脏纤维化有关，检测肾脏CTGF含量可考虑作为评价肾脏纤维化的方法。

在眼组织纤维化研究方面，CTGF被发现可以促进体外培养兔的角膜成纤维细胞增殖、向成肌纤维细胞转化和合成细胞外基质[14]。也可以促进人晶状体上皮细胞α-SMA基因和蛋白的表达，并且随浓度的增加作用增强。可促进晶状体上皮细胞细胞外基质的合成[15]。CTGF也能够促进人视网膜色素上皮细胞ARPE-19细胞增生，而CTGF RNAi不但能够显著抑制其增生，还可显著抑制由划痕实验引发的ARPE-19细胞的迁移。此外，CTGF可通过上调α-SMA表达水平而增强ARPE-19细胞对于TGF-β1的反应，CTGF RNAi可使TGF-β1诱导的上皮细胞-间充质细胞转变(EMT)减弱[16]。TGF-β能够明显地促进Tfb细胞增殖，并增强其下游介质CTGF的表达和合成细胞外基质-纤维连接蛋白[17]。

我们以体外培养POAG患者的Tfb作为研究对象，观察了CTGF对其增殖和表型转化的影响，并首次报道了CTGF对Tfb移行的影响。结果显示细胞作用24h后，1.0ng/mL CTGF对Tfb的增殖、移行无明显作用，而10.0、100.0ng/mL CTGF能明显促进成纤维细胞的增殖、移行。细胞作用48h后，10.0、100.0ng/mL CTGF能够上调α-SMA mRNA的水平，10.0、100.0ng/mL CTGF刺激后Tfb α-SMA蛋白表达呈强阳性。本研究发现CTGF组能促进POAG患者Tfb的增殖、移行，并促进其向肌成纤维细胞转化，推测CTGF可能在滤过道和滤过泡的创伤修复和纤维化过程中扮演重要作用。针对CTGF的靶向治疗有可能开辟一条仅特异作用于TGF-β引起的纤维化作用，而不影响其它免疫活性作用发挥的新途径，为青光眼滤过术后瘢痕形成的防治提供新的方向。