碱烧伤诱导兔部分性角膜缘干细胞失代偿模型

高晴琴, 王 平, 王 娟, 孙 明, 徐玲娟, 王 玮, 朱 晖, 江梦琳, 胡维琨, 李新宇, 李贵刚

0引言

角膜上皮位于正常角膜的最表层，是保护角膜免受病原体侵害的重要屏障，对保持角膜的完整和透明性至关重要。角膜上皮由复层鳞状上皮细胞组成，一生都处于不断地更新保持动态平衡状态[1]。正常角膜缘干细胞(limbal stem cells，LSC)是维持角膜上皮更新的必备条件。LSC可以分裂为两种细胞，一种是新一代的LSC细胞，维持恒定的干细胞群，这个过程被称为自我更新(self-renew)；另一种是瞬时扩增细胞(transit amplifying cells，TAC)，这一过程被称为分化(differentiation)，TAC细胞具有旺盛的分裂增殖能力，向角膜中央不断移行，以填充角膜上皮的基底层，这些基底细胞可以持续分裂或进入细胞周期，形成角膜基底层上皮细胞和成熟的表层上皮细胞[2-3]。各种原因都会造成LSC的损伤，从而导致角膜缘干细胞失代偿(limbal stem cell deficiency，LSCD)，如化学或热烧伤，Stevens Johnson综合征、Sjögren综合征及其他眼表慢性炎症。LSCD可以导致角膜上皮迁延不愈、角膜上皮结膜化、角膜新生血管、角膜混浊等病理改变，从而严重影响患者视力乃至致盲，并且成为同种异体角膜移植失败的重要原因。

近年来，许多研究小组运用各种动物、不同方法制作LSCD模型，用以研究LSCD发生机制，并期望寻找治疗这一疾病的最佳方法，LSCD模型的制作是这类相关研究的基础。本研究采用去除兔第三眼睑的方法，有效利用了颞上方角膜结膜容易暴露观察的特点，记录了一组采用碱烧伤诱导兔部分性LSCD的动物模型制作新方法，现报告如下。

1材料和方法

1.1材料选取30只眼部健康的C57小鼠、19只眼部健康新西兰白兔、1mol/L KOH溶液(0.56g KOH溶于10mL去离子水中配制而成)、滤纸、氯胺酮、0.25%盐酸奥布卡因滴眼液、生理盐水、0.5%盐酸左氧氟沙星滴眼液、醋酸纤维素微孔滤膜、4%多聚甲醛、Schiff氏溶液、苏木素染液、亚硫酸钠溶液、PBS液、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、蒸馏水、1%盐酸酒精、二甲苯、伊红染液。

1.2方法本研究由华中科技大学同济医学院附属同济医院伦理委员会审核通过,并遵守实验动物操作伦理学规定。

1.2.1小鼠完全性LSCD模型制作方法根据文献报道的方法[4]，小鼠中央角膜碱烧伤诱导LSCD。C57小鼠腹腔内注射氯胺酮(100mg/kg)全身麻醉，左眼滴0.25%盐酸奥布卡因滴眼液，每分钟1次合计3次表面麻醉。取直径3mm圆形滤纸片置于1mol/L氢氧化钾溶液中浸润，用镊子夹取滤纸片，在一张新的滤纸上吸掉多余的液体，置于左眼中央角膜表面与角膜紧密贴敷，烧灼30s，用20mL生理盐水充分冲洗(图1A)。右眼不做烧灼，作为正常对照。

1.2.2兔部分性LSCD模型制作方法新西兰白兔肌肉注射氯胺酮(35mg/kg)全身麻醉，左眼滴0.25%盐酸奥布卡因滴眼液，每分钟1次合计3次表面麻醉，剪刀去除兔眼瞬膜(第三眼睑)，取直径5mm圆形滤纸片置于1mol/L氢氧化钾溶液中浸润，将浸湿的滤纸片置于颞上方角膜表面，30s后立即用生理盐水冲洗(图1B)，右眼作为正常对照。

1.2.3角膜印迹细胞学检查方法兔结膜囊内滴0.25%盐酸奥布卡因1滴，等待2min后用滤纸吸去多余泪液,显微无齿镊夹取己消毒的醋酸纤维素薄膜滤纸(预先裁剪为高约4mm的三角形)，将三角尖对角膜，底边对结膜，粗糙面贴于球结膜、病变角膜及透明角膜处，稍加压10s，印取表层上皮细胞，将滤纸片置于4%多聚甲醛溶液中固定，固定好的样品采用PAS染色(periodic acid-schiff stain)之后放置于显微镜下观察。

图1 角膜碱烧伤法诱导LSCD示意图 白色区域为角膜表面滤纸片烧灼部位，采用1mol/L氢氧化钾溶液浸泡滤纸片烧灼30s，再用生理盐水冲洗干净 A：C57小鼠，滤纸片直径3mm；B：新西兰白兔，滤纸片直径5mm。T：颞侧N：鼻侧。

图2 鼠完全性LSCD模型不同阶段前段照相及2mo病理切片 A：正常小鼠角膜；B：小鼠角膜碱烧伤后2wk；C：小鼠角膜碱烧伤后2wk，角膜混浊，新生血管长入；D：小鼠角膜碱烧伤后1wk，角膜穿孔；E：碱烧伤2mo鼠完全性LSCD模型角膜切片HE染色，上皮层可见大量杯状细胞(×400)；F：碱烧伤2mo鼠完全性LSCD模型角膜切片HE染色，基质层可见大量新生血管(×400)。

1.2.4 HE染色方法对取得的角膜组织进行石蜡包埋、切片后用二甲苯进行脱蜡，随后分别用无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇以及蒸馏水进行复水，用苏木素染液进行细胞核染色之后再用伊红染液进行细胞质染色，随后分别用70%的乙醇、80%乙醇、95%乙醇、无水乙醇进行脱水，将脱水后的切片放入二甲苯中浸泡使切片透明，最后用快干胶将切片封固，置于显微镜下观察。

1.2.5观察指标小鼠及白兔角膜碱烧伤后双眼滴用0.5%盐酸左氧氟沙星滴眼液，4次/d。术前、术后1、2、4wk,2mo采用裂隙灯显微镜观察、摄像，观察角膜上皮愈合时间，记录角膜溃疡、穿孔等并发症。术后2mo处死小鼠，角结膜切片检测角膜新生血管分布情况。计算碱烧伤诱导鼠完全性LSCD模型成功率。术后2mo采用印迹细胞学检测兔眼表杯状细胞分布(正常角膜区域、LSCD角膜区域、结膜)。处死动物，角结膜切片观察角膜新生血管、杯状细胞密度。计算利用碱烧伤诱导兔部分性LSCD模型成功率。

LSCD的诊断标准: (1)裂隙灯检查见全部或部分角膜缘正常结构丧失、角膜新生血管。(2)角膜印迹细胞学检查可见杯状细胞[5-7]。

2结果

角膜碱烧伤后观察2mo，30只小鼠中，6只因麻醉意外死亡，2只分别在第7d和第14d出现了角膜穿孔，其余 22只小鼠发生不同程度完全性LSCD，诱导成功率92%，表现为角膜新生血管、角膜混浊。19只白兔，其中7只因麻醉意外死亡，12只白兔造模成功,诱导成功率100%，在观察过程中，未出现角膜穿孔的情况。两种方法造模成功率比较差异无统计学意义(P=0.543)。

正常小鼠结膜无充血，角膜透明，角膜缘血管网清晰可见，通过透明的角膜，可以清晰显示虹膜纹理、瞳孔大小、晶状体透明(图2A)。角膜中央碱烧伤后2wk，部分小鼠LSCD程度适中，表现为无明显充血，中等程度角膜新生血管，纤维血管膜长入角膜，中央角膜混浊，无法透过角膜看清虹膜及瞳孔情况，这是比较理想的LSCD模型(图2B)。角膜中央碱烧伤后2wk，部分小鼠LSCD程度严重，表现为睫状充血+++，大量角膜新生血管，中央角膜溃疡，无法透过角膜看到虹膜及瞳孔情况，这种LSCD很难治愈，不是理想的LSCD模型(图2C)。角膜中央碱烧伤后1wk，部分小鼠角膜溃疡穿孔，无法透过角膜看到虹膜及瞳孔情况，这种被判定为LSCD模型制作失败，无法用于进一步的LSCD治疗模型(图2D)。碱烧伤后2mo，小鼠角膜病理切片HE染色可见角膜上皮杯状细胞长入(图2E)，基质有大量新生血管(图2F)。

图3 兔部分性LSCD模型不同阶段前段照相和印记细胞学PAS染色及病理切片 A、E：碱烧伤后1wk；B、F：碱烧伤后2wk；C、G：碱烧伤后1mo；D、H：碱烧伤后2mo；I：碱烧伤后2mo兔部分性LSCD模型正常角膜部分印迹细胞学PAS染色阴性(×400)；J：碱烧伤后2mo病变角膜印迹细胞学PAS染色显示大量杯状细胞(×400)；K：碱烧伤后2mo角膜切片HE染色，上皮层可见大量杯状细胞(×200)；L：碱烧伤后2mo角膜切片HE染色，基质层可见大量新生血管(×200)。

兔角膜碱烧伤后1wk，表现为轻度角膜新生血管，尚未见纤维血管膜长入角膜，角膜烧伤局部混浊明显，无法透过角膜看清虹膜及瞳孔情况，其他部位可透过角膜看清虹膜及瞳孔纹理(图3A)，烧伤局部角膜上皮荧光素钠染色阳性(图3E)。兔角膜碱烧伤后2wk，LSCD程度适中，表现为中等程度角膜新生血管，纤维血管膜长入角膜，烧伤局部角膜混浊明显，其他部位角膜轻度混浊，可隐约窥见虹膜及瞳孔纹理(图3B)，角膜荧光素钠染色见局部角膜上皮缺损范围增大(图3F)。角膜碱烧伤后1mo，表现为角膜大量新生血管，角膜混浊加重，无法透过角膜看到虹膜及瞳孔情况(图3C)，角膜荧光素钠染色可见大片上皮缺损(图3G)。角膜碱烧伤后2mo，结膜无充血，角膜上皮愈合，新生血管减少，角膜混浊，无法透过角膜看到虹膜及瞳孔情况(图3D)，角膜荧光素钠染色阴性(图3H)。透明角膜部位印迹细胞学PAS染色未见杯状细胞(图3I)，混浊角膜部位可见大量杯状细胞(图3J)。角膜病理切片HE染色可见角膜上皮杯状细胞长入(图3K)，基质新生血管主要位于浅层(图3L)。碱烧伤后2mo，2只白兔角膜新生血管累及2个象限，其余10只白兔均仅累及1个象限，平均累及1.17±0.39个象限。在高倍镜(HP,×400)下对12只兔部分性LSCD模型的角膜杯状细胞计数，平均角膜杯状细胞数为58.60±12.58个细胞/HP。

3讨论

3.1模型动物选择兔还是小鼠用于制作LSCD模型的动物大多选用兔[8-27]和小鼠[4-5,28-29]，兔眼大小更接近人眼，与小鼠相比角膜面积更大，因此有利于模型成功和手术操作。且兔子性情温顺，极少伤人，在制作LSCD模型时更易操作、更易观察，拍摄照片时也更加清晰。Ti等[11]在完全性LSCD兔模型上观察到鼻侧的新生血管多于其他方向，认为兔眨眼速度慢，且存在瞬膜，会对眼表施加额外的摩擦力，尤其是鼻侧。瞬膜的存在可能会影响碱烧伤的操作和日常的角膜病变观察记录。因此我们选择去除兔眼的瞬膜，这样在观察和拍照的时候就可以不受此影响。小鼠的眼球较小，进行操作、测量新生血管面积及照相的难度都较兔子大，但小鼠可供选择的抗体较兔子齐全，有利于在同类研究中的比较。因此两种动物模型各有优缺点。

3.2完全性LSCD模型还是部分性LSCD模型就近几年的研究来看，制作完全性LSCD模型[5,8,11-15,18,20-25,28-29]的研究远远多于部分性[9-10,16-17,19]。但是这种研究模型在检验治疗方法的有效性的时候有一定局限性，因为合并严重的角膜病变，无论是研究组还是阳性对照的治疗方法都不容易获得治愈效果，或者治疗效果不显著，这样就难以做出治疗方法的优劣性判断。角膜化学伤诱导LSCD，目前报道的均为完全性LSCD，往往合并严重的角膜混浊、深层新生血管等病变。由于中央角膜碱烧伤损伤范围大，容易发生角膜溃疡不愈合、角膜穿孔而导致造模失败。Ma等[4]在研究骨髓间充质干细胞重建鼠化学烧伤眼表时发现，80只鼠在化学烧伤1wk后有29只(36%)因出现了严重的前房积血、前房积脓、角膜穿孔而退出研究。郭滨等[27]运用不同碱烧伤方法制作兔完全性LSCD模型时A组兔眼由于NaOH在角膜缘停留时间过长，6只眼全部出现角膜穿孔、眼球萎缩而造模失败；B、C组造模成功但B组因为在结膜囊滴入NaOH而导致睑球粘连。睑球粘连并非是LSCD的必要体征，且不利于后期进行LSCD治疗方法的相关研究。相反，如果LSCD动物模型的损伤比较局限于表层组织，那么治疗方法容易取得眼表健康改善、视觉改善等阳性指标，并与对照组形成比较明显的对比，从而发现有用的治疗方法，并且客观定量评价治疗效果。

此外，由于动物角膜暴露困难，完全性LSCD模型不便于观察和照相，以及印迹细胞学检查等操作。而部分性LSCD模型更便于观察，前段照相时兔配合情况好，烧伤操作时更易精确控制部位和时间，成功率高。在研究LSCD微环境重建，比如角膜缘微环境细胞(limbal niche cells，LNC)的移植时，就更适合采用仍存有部分自体角膜缘干细胞的部分性LSCD模型。

尽管碱烧伤诱导兔部分性LSCD模型与碱烧伤诱导鼠完全性LSCD模型的成功率差异无统计学意义，但前者在2mo的时候已经进入无充血、角膜上皮结膜化的炎症稳定阶段，而这是接下来用于检验LSCD治疗方法有效性的理想状态。相对于以往报道的3mo制作时间，这种动物模型具有缩短实验周期，提高研究效率的优点。

3.3使用机械手法还是碱烧伤制作的LSCD动物模型的方法主要有2种，一种是机械损伤角膜缘[8-11,14-15,17,19-22,25-26,29]；另一种是化学烧伤，多采用碱，如NaOH[4-5,12-13,20-21,23-24,27]、KOH[16]等，少见的有硫芥子气[18]。机械损伤角膜缘的优点是可控性较好，可以诱导不同程度的LSCD，包括完全性LSCD和部分性LSCD[30]，然而这种模型与临床病例的吻合度较低，因为临床上最常见的LSCD发病原因为各种化学或热烧伤。2017年中山眼科中心的一项研究对碱烧伤和角膜缘机械切除联合角膜上皮刮除这两种方法制作的完全性兔LSCD模型进行了比较。该研究表明这两种方法均可造模成功，碱烧伤组的角膜混浊、新生血管化较机械切除组严重，适合用于与新生血管相关的研究；角膜缘机械切除联合上皮刮除对角膜基质的损伤较小，角膜基质的微环境保存良好，更适合于研究干细胞的分化、转化、干细胞相互作用、微环境及干细胞替代疗法[21]。机械手法对术者技巧要求较高，无疑增加了可重复性的难度。最重要的是，在临床中导致LSCD的病因并非机械损伤，而是化学烧伤，特别是碱烧伤所导致。所以，采用碱烧伤的方法制作LSCD模型更贴合临床患者的实际情况。

综上所述，目前关于制作LSCD模型的研究中极少提及模型的制作成功率，而这一指标对研究者选择动物模型，提高研究效率有重要意义。本研究的结果提示碱烧伤诱导LSCD模型是比较可靠的方法(鼠完全性LSCD的成功率及兔部分性LSCD的成功率分别是92%和100%)。尽管两种方法诱导LSCD模型的成功率差异没有统计学意义，相对于小鼠完全性LSCD，兔部分性LSCD具有成功率高、易于暴露病变区域进行观察记录的优点，因此可能具有更高的可重复性，有利于不同研究者之间的结果比较和客观评价，是一种比较好的LSCD研究动物模型。剪除第三眼睑使这种部分性LSCD兔动物模型更易于被观察和记录。