西瓜炭疽病接种技术规程

魏春华 郜森 甘露 罗婷 张勇 李好 马建祥 杨建强 张显

摘 要： 西瓜是我国重要的葫芦科经济作物。炭疽病作为一种在西瓜整个生长期广发的真菌性病害，已严重影响了我国西瓜产业的健康可持续发展。现根据西瓜炭疽病的生物学特性，结合已有的研究成果，对西瓜炭疽病的危害症状、病原菌形态学特征、西瓜炭疽病病菌的分离及培养、人工接种鉴定技术等作了描述和规定，并制定了西瓜炭疽病接种技术规程。

关键词： 西瓜； 炭疽病； 人工接种； 鉴定标准； 技术规程

西瓜是葫芦科重要的经济作物，是世界第五大水果。我国是最大的西瓜生产和消费国。据中国农业统计资料显示，2016年我国西瓜的种植面积为189.08万hm2，总产量高达7 940万t。因此，西瓜在我国农业结构调整和农民增收中发挥着重要的作用[1]。

炭疽病作为一种真菌性病害，在西瓜的整个生长期都可发生，其对西瓜的危害仅次于枯萎病。西瓜炭疽病由瓜类炭疽病菌[Colletorichum lagenerium （Pass.） Ell.et Halst]引起，属半知菌亚门，黑盘孢目，刺盘孢属真菌。目前，已知的瓜类炭疽病菌有7个生理小种，其中生理小种1和3对西瓜的危害最大[2]。不同的生理小种可通过特定的鉴别寄主进行鉴定。潮湿环境可引起该病的大规模爆发，造成西瓜减产，甚至绝收[3]。因此，种植户在防治过程中，往往会滥用化学农药，不仅造成投入成本的增加，同时也在一定程度上影响了西瓜的品质，甚至对生态环境造成破坏。而抗性品种的选育将在根源上解决这一生产难题。基于此，笔者根据西瓜炭疽病的生物学特征及病害症状，结合已有的研究基础制定了西瓜炭疽病的人工接种鉴定技术规程，该规程经多次应用验证，适合于西瓜炭疽病的鉴定，为抗病种质的筛选提供可靠的参考依据。

1 西瓜炭疽病病害癥状

叶片染病初期为黄色水渍状圆形小斑，后小斑逐渐扩展并附有同心轮纹，病斑直径0.5～1.5 cm，易穿孔，呈褐色且外缘常伴有黄色晕圈（图1）。通常病斑颜色较为均匀，上面有散生黑色小点，当环境湿度增大时，会出现粉红色黏稠状胶状物。后期病叶由于病斑易干枯破碎而早衰。若叶柄或蔓上染病，初期呈现水浸状黄褐色的梭形或长椭圆凹陷病斑，后病斑逐渐扩大并转变黑褐色，最后引起茎蔓逐渐死亡。若果柄染病，初期幼果颜色深暗，后逐渐萎缩致死。若果实染病，初期为暗绿色油渍状小斑点，后逐渐扩大成表面凹陷并附有轮纹的圆形暗褐色病斑，通常随着病斑的生长，在中央会出现龟裂（图1）。当空气湿度大时，病斑上出现黑色小颗粒，并有粉红色黏稠的分生孢子团，严重时，病斑连片，西瓜腐烂，失去商品性，从而造成西瓜减产[4]。在西瓜的贮放或运输过程中，炭疽病也时常发生，从而造成西瓜腐烂、变质失去商品价值，造成损失。

2 西瓜炭疽病病原菌形态学特征

西瓜炭疽病通常由瓜类炭疽病生理小种1或3引起。瓜类炭疽病菌分生孢子盘生有黑褐色刚毛，长90～120 ?m，具有2～5个隔膜，初期埋于寄主表皮下，成熟后突破表皮外露（图2）。其分生孢子梗无色，单孢呈圆筒状，大小为（20～ 26） ?m×（2.6～3.0） ?m。分生孢子无色，单孢为卵圆或长圆形，具有2～3个横膈膜，大小为（14～20） ?m×（5～6） ?m，多个孢子聚合一起形成粉红色黏孢子团。

随着炭疽病菌在培养基上不断生长，菌落逐渐形成。培养2～3 d后，菌落为乳白色且有绒毛状的气生菌丝；3～5 d后，菌落在增大的同时变为粉红色，颜色从中心到边缘渐浅；5～7 d后，菌落颜色由中心至边缘变为深灰色，边缘波状，出现同心轮纹；7～12 d后，菌落变为深灰色，且边缘有一圈淡粉色晕圈；在培养12～15 d后，菌落出现红褐色黏稠状孢子团。

3 西瓜炭疽病的分离及培养

抗病材料的筛选无疑会为西瓜抗炭疽病品种的选育提供重要的材料资源。不同西瓜材料对炭疽病抗性的鉴定可分为自然条件下的抗性鉴定和人工接种抗性鉴定，前者受环境因素的影响较大，且周期长、不定因素较多，不易控制；而后者可显著地缩短鉴定周期，且可减少环境因素的影响，故可相对准确地鉴定出不同材料对炭疽病的抗性。但瓜类炭疽病菌在普通的培养基上只长菌丝而少产孢子。因此，如何在短期内获得足够的炭疽病孢子就成为了人工接种鉴定材料抗病性的关键步骤[6]。

3.1 病原菌分离

从田间采集病叶（或其他感病组织），先经过0.1% HgCl2消毒2 min，再用灭菌的蒸馏水冲洗3～4次后，放置在已经过高温灭菌的铺有滤纸的培养皿中，保湿2～3 d后，挑取少量产生的孢子于无菌水中制成孢子悬浮液。用接种环接种少量孢子悬浮液于PDA培养基上，置于25 ℃恒温培养箱中培养。待病原菌在恒温培养箱培养2～3 d，长成为直径约1 cm的菌落后，目镜检测，并挑取边缘少量菌丝于新的PDA培养基上，进行二次转接培养。如此经过3～4次转接后，可使菌种得到纯化。每次转接前，需对菌落形态和颜色进行观察，同时镜检，确认为西瓜炭疽病菌。

3.2 病原菌回接鉴定

在抗性鉴定之前，为确保分离得到的是西瓜炭疽病病原菌，将分离纯化的病原菌配成1×106个·mL-1的孢子悬浮液。采用喷雾法将孢子悬浮液接种于感病材料‘玲珑王的西瓜幼苗上，20株为1组，重复3次。将接种后的西瓜幼苗置于24～26 ℃、相对湿度（RH）为95%～100%的黑暗条件下保湿48 h后，再置于正常的生长环境中，观察发病情况。

3.3 病原菌孢子繁殖

为获得用于抗病性鉴定的大量孢子悬浮液，将上述经过回接验证的孢子用无菌蒸馏水悬浮后（或直接挑取少量菌丝），接种于培养基上置于25 ℃恒温培养箱中培养。试验表明，接种于西瓜皮培养基上再培养10 d左右，即可获得粉红色孢子团；而在PDA培养基需要培养12～15 d才可产孢子。因此在有果实的季节，推荐使用西瓜果皮培养基；其他时候推荐PDA培养基。

西瓜果皮培养基配方：200 g西瓜果皮煮汁+15 g琼脂，定容至1 L；

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基配方：去皮马铃薯200 g，加水1 L，煮沸30 min，纱布过滤后+20 g葡萄糖+ 15 g琼脂，定容至1 L。

4 西瓜炭疽病人工接种

将扩繁的孢子团用无菌蒸馏水稀释至1×106个·mL-1，以无菌水为对照。采用喷雾法接种于待鉴定的不同西瓜种质幼苗（2叶1心时期），以15～25株幼苗为1组，重复3次，采用随机区组试验法。接种后的幼苗置于24～26 ℃、相对湿度（RH）为95%～100%的黑暗条件下保湿48 h后，置于正常生长条件下。接种3 d后，观察感病情况。根据刘莉等[7]研究，计算病情指数（DI）。

离体叶人工接种方法同样能够真实地鉴定西瓜种质的抗病性[8]。选取叶龄为15～20 d的真叶（剪口用石蜡固封），同样将孢子团用无菌蒸馏水稀释至1×106个·mL-1，以无菌水为对照，采用微量注射器进行悬滴法接种（30滴左右）。将接种后的叶片放置于4层饱和吸水（无菌水）的滤纸上，并用塑料薄膜覆盖保湿（相对湿度100%）后，置于灭菌后的培养皿中。在24～26 ℃的培养箱中黑暗处理24 h后，置于正常生长条件下，6 d后观察发病情况。采用平均病斑直径法（Average Diameter of Lesion，简称AD）进行发病统计[8]。

5 西瓜炭疽病的鉴定标准

参考刘莉等研究[7]，根据叶片病斑数目及植株整体生长情况，将西瓜幼苗对炭疽病的抗性分为6个等级：0、1、3、5、7、9。0级：无病斑；1级：轻微侵染，仅子叶上有少数小病斑（1～5个）；3级：中度侵染，真叶发病，少数病斑（6～10个）；5级：严重侵染，病斑较多（11～20个）；7级：侵染非常严重，坏死斑扩大；9级：发病严重，植株死亡。病情指数（DI）计算公式如下：

DI=[各病情指数×该病情代表数最高病级代表数×调查总株数][×]100

其抗性分级标准：0为免疫；11%以下为高抗；12%～33%为抗病；34%～55%为轻度抗病；56%～77%为感病；78%以上为高感。

鉴于上述鉴定方法在等级划分时，存在人为主观造成的试验误差且数据计算复杂，故建议采用平均病斑直径法（AD）进行发病统计[8]。病情指数（AD）计算公式如下：

AD=[发病病斑直径/mm接种总滴数]

其中分子为各病斑直径的总和，而分母为接种总滴数，包括发病接种滴数和未发病接种滴数。根据AD值，按以下抗性分级标准对材料炭疽病抗性进行划分：0.0 mm，免疫；<0.50 mm，高抗；0.51～1.50 mm，抗病；1.51～2.00 mm，中抗；2.01～3.00 mm，感病；>3.01 mm，高感。

本技术规程对西瓜炭疽病的形态学特征和病害症状进行了详细描述，同時对病原菌的扩繁、接种方法及抗病鉴定指标进行系统性规范。该技术规程的制定，将为炭疽病抗性种质资源的筛选提供技术指导，进而为抗性新品种的选育奠定基础。

参考文献

[1] 农业部. 2016年全国各地蔬菜、西瓜、甜瓜、草莓、马铃薯播种面积和产量[J]. 中国蔬菜，2018（1）： 18.

[2] 崔丽红，黄蔚，成娟. 西瓜抗炭疽病遗传育种的研究进展[J]. 贵州农业科学，2014（8）： 172-174.

[3] 梅丽艳，王喜庆，贾云鹤，等. 西瓜炭疽病症状观测及发生危害调查[J]. 黑龙江农业科学，2016（12）： 55-58.

[4] 韩华，崔志红. 西瓜常见病害及其综合防治技术[J]. 安徽农学通报，2008，14（3）： 141-141.

[5] 罗婷. 西瓜苗期炭疽病抗性鉴定方法及其抗病机理研究[D]. 陕西杨凌：西北农林科技大学，2008.

[6] 刘志恒，唐爽爽，杨璐，等. 西瓜炭疽病菌圆刺盘孢分生孢子产生条件的研究[J]. 菌物学报，2015（1）： 75-81.

[7] 刘莉，王鸣. 西瓜种质资源苗期对炭疽病抗性的研究[J]. 中国西瓜甜瓜，1990，3（1）： 9-13.

[8] 文生仓，王鸣. 西瓜炭疽病人工接种鉴定的新方法──离体叶接种和AD评价法[J]. 西北农业大学学报，1994，22（1）： 17-22.