高气压光电离-化学电离-飞行时间质谱在绿茶香型快速鉴别中的应用

李庆运 花磊 何梦琦 李佳 蒋吉春 侯可勇 田地 李海洋

摘 要 茶香是决定茶叶品质的重要因素之一。本研究基于动态顶空进样-高气压光电离-化学电离-飞行时间质谱仪（HPPI-CI-TOFMS），结合偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）和层聚类分析（HCA）等多元统计分析技术，建立了一种快速鉴别绿茶香型的方法，并通过受试者工作特征曲线（ROC）以及置换检验对分类方法进行评估。采用本方法对收集自四川、贵州、浙江、安徽等不同产地的4种香型（嫩香型、栗香型、嫩栗香型、熟栗香型），共31个绿茶样品进行茶香挥发性有机物（VOCs）指纹谱分析。在所得茶香VOCs的HPPI/CI质谱图中，不同香型绿茶特征谱峰的种类和相对强度差异明显; 多元统计分析结果表明，同种香型的绿茶样品挥发性茶香成分的自身差异较小，但不同香型之间存在较大差异，可实现准确的分类鉴别，方法模型对未知样品的预测能力达到85.1%，并通过样本验证组测试了该模型的准确度。本方法为绿茶香型的有效鉴别提供了新的思路和途径，在食品的品质评价和质量安全等领域具有潜在的应用价值和良好的发展前景。

关键词 高气压光电离-化学电离; 飞行时间质谱; 绿茶香型; 多元分析; 挥发物指纹谱

1 引 言

茶是世界上最受欢迎的饮料之一[1]，绿茶是我国重点出口茶类，占世界绿茶总量的85%以上[2]。茶多酚、茶碱及茶香是评价茶叶品质的3个重要指标[3]。其中，茶香是茶叶的内在核心因子，是决定茶叶品质的重要因素。因此，对茶香的研究意义重大[4]。茶香由具有芳香气味的挥发性有机物（Volatile organic compounds，VOCs）組成，具有含量低、组成复杂、易挥发、不稳定等特点[5]。传统的茶香评价主要依靠专业人员感官评审完成，需要评审人员长期的专业知识以及经验积累，同时容易受外部环境以及主观因素的影响，一定程度上限制了其评价的客观性[6]。

随着现代分析技术的发展，气相色谱-质谱联用（Gas chromatography-mass spectrometry， GC-MS）[7～9]、近红外光谱[10～12]、毛细管电泳[13]、电子鼻[14，15]等技术逐渐应用于茶叶种类、品质、产地的鉴别分析。1995年，Togari等[16]基于GC及GC-MS技术，对不同生产工艺的红茶、绿茶和乌龙茶的茶香挥发性组分进行了模式识别分析。Dutta等[17]将电子鼻技术应用于茶叶香气品质的评价。李晓丽等[2]提出了一种可见-近红外光谱技术快速无损分类、鉴别茶叶品种的分析方法。黄海涛等[18]利用电子鼻技术，结合固相微萃取（Solid phase micro-extraction， SPME）和GC-MS技术， 实现了不同茶叶样品香味的辨别。Zhang等[19]利用二维色谱-飞行时间质谱（Two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry， GC×GC-TOFMS）技术分析了33个茶叶样品，并基于多元数据统计方法对茶叶样品进行归类分析。Li等[20]首次将离子迁移谱（Ion mobility spectrometry， IMS）技术应用于茶香分析，利用丙酮辅助光电离-正离子模式IMS实现茶叶样品无损、快速、实时指纹图谱分析。但这些方法具有各自的局限性，如GC技术耗时长、预处理复杂; 电子鼻技术稳定性较差、灵敏度低; 光谱技术易受基质干扰; 离子迁移谱分辨率不高、定性分析能力不足等。

在线质谱检测技术的分辨率高、检测速度快且通用性好，特别是得益于近年来各种软电离源技术的快速发展，使其成为VOCs快速分析领域的研究热点之一。软电离技术以产生分子离子或准分子离子为主，碎片化程度低，谱图简单，易于实现复杂混合物的快速定性和定量分析[21]。基于软电离技术的在线质谱分析方法在茶学领域的应用日益广泛。梁华正等[22]采用表面解析常压化学电离质谱（Surface desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry， SDAPCI-MS）测定了庐山云雾、铁观音、祁门红茶及普洱茶4种茶叶的化学指纹图谱。张佳玲等[23]基于实时直接分析质谱（Direct analysis in real time mass spectrometry， DART-MS）技术建立了一种原位、简单、快速、准确鉴别不同种类茶叶的方法，用于8种茶叶的鉴别分析。Yener等[24]采用质子转移反应-飞行时间质谱（Proton transfer reaction time-of-flight mass spectrometry， PTR-TOFMS）对收集自不同国家的上百个黑茶与绿茶样品进行指纹图谱分析。张丹丹等[25]同样采用PTR-TOFMS构建了3个产地的茶香指纹图谱，结合主成分分析（Principal component analysis， PCA）方法成功实现不同产地闽北水仙茶的快速鉴别。单光子电离-飞行时间质谱（Single photon ionization time-of-flight mass spectrometry， SPI-TOFMS）采用基于真空紫外（Vacuum ultraviolet，VUV）光的阈值光电离技术，其分子离子产率高，具有灵敏度高、分析速度快、分辨能力强等显著优势，已广泛应用于工业过程[26，27]、生态环境[28，29]、公共安全[30]、医疗诊断[31]、食品安全[32]等领域痕量有机物的快速、在线分析。为了进一步提高SPI-TOFMS的电离效率并拓宽待测物的检测范围，Hua等[33]基于发射光子能量为10.0 eV/10.6 eV的小型氪气（Kr）放电VUV灯，发展了单光子电离-化学电离（Single photon ionization-chemical ionization， SPI-CI）复合电离源，不仅有效提高了仪器检测灵敏度，而且实现了电离能（Ionization energy，IE）高于光子能量的氯代烃，如三氯甲烷（CHCl3，IE=11.37 eV）、一溴二氯甲烷（CHBrCl2，IE=10.96 eV）的有效电离和检测[34]。在此基础上， Wang等[35]采用了将电离源气压提高到kPa量级的方法，分别开发出高气压光电离（High-pressure photoionization，HPPI）源和高气压光电子诱导的O2+阳离子化学电离（High-pressure photoelectron-induced O2+ cation chemical ionization， HPPI-OCI）源，在保证较宽检测范围的同时，有效改善了仪器灵敏度，对甲苯的检出限低至0.05 μg/m3。

本研究采用高气压光电离-化学电离-飞行时间质谱（High-pressure photoionization-chemical ionization time-of-flight mass spectrometry，HPPI-CI-TOFMS）分析了4种香型（嫩香型、栗香型、嫩栗香型和熟栗香型）、共31个绿茶样品。采用动态顶空采样法进行香气提取，HPPI-CI-TOFMS采集茶香VOCs组分的指纹图谱，结合PLS-DA及层聚类分析（Hierarchical cluster analysis， HCA）的数据处理方式，建立了客观、精确、快速的分析方法，可对绿茶香型进行准确、可靠鉴别。

2 实验部分

2.1 试剂与样品

茶叶样品包括西湖龙井、谢裕大、蒙顶山等不同产地和品牌，共计4种香型、31个绿茶样品，有嫩香型6个、栗香型10个、嫩栗香型9个及熟栗香型6个，详细信息见表1。绿茶样品均取自中国农业科学院茶叶研究所绿茶库，所属香型由中国农业科学院茶叶研究所6位认证专家根据《茶叶感官审评方法（GB/T 23776-2009）》对茶叶样品进行感官评价所得。绿茶样品在分析前在10℃环境中密封存储，载气所用洁净空气由中国科学院大连化学物理研究所提供。

2.2 分析仪器

HPPI-CI-TOFMS由中国科学院大连化学物理研究所快速分离与检测课题组自行研制[35]。图1为动态顶空进样系统及飞行时间质谱仪整体结构示意图。动态顶空进样系统由载气、质量流量计、顶空采样瓶及恒温水浴锅组成。取适量绿茶樣品置于顶空采样瓶底部，并将顶空采样瓶置于恒温水浴锅内，利用恒温水浴锅加热促进茶香成分挥发。经质量流量计控制一定流速的洁净空气作为载气，载带绿茶样品茶香VOCs成分流出顶空采样瓶。于顶空采样瓶出口处设置有一个三通连接器，一端通过一段长40 cm、内径250 μm的PEEK毛细管直接通入HPPI-CI电离源内部，另一端注入尾气吸收处理系统。香VOCs成分冷凝或吸附，质谱进样流速约为30 mL/min。所采用的电离源为HPPI-CI复合离子源，可以通过快速切换，分别在HPPI和HPPI/CI两种电离模式下工作。HPPI模式下，电离区电场强度低，待测样品分子主要通过吸收光子电离; HPPI/CI模式下，电离区电场强度高，光电子加速后会与试剂气体分子之间碰撞电离产生大量试剂离子，待测样品分子受到HPPI和CI的共同作用，其中电离能低且光吸收截面大的分子以光电离为主，而电离能高或者吸收截面相对低的分子则以电荷转移或者质子转移等方式为主。因此，HPPI/CI可电离的物质种类更多，且电离效率更高。本研究中，为了提高茶香VOCs分子的电离效率，获得足够多的组分信息以实现绿茶香型的鉴别，均采用HPPI/CI电离模式。茶香VOCs成分通过PEEK毛细管进入电离区后，由高气压光电离及化学电离产生待测样品的特征离子，离子在电场的作用下到达检测器， 实现检测分析。

2.3 实验方法

实验过程中，设置恒温水浴温度为70℃，顶空采样瓶在样品测试前预热3 min。设置载气流速500 mL/min， 采集空气背景质谱图，每张质谱图3 min，连续采集3张，取平均值作为空白对照谱图。准确称取200 mg绿茶样品放置于顶空采样瓶中，密封后接入载气吹扫进样，采集绿茶样品顶空气质谱图，每张质谱图采集3 min，连续采集3张，取平均值得到样品测试谱图，样品测试顺序随机。

2.4 数据分析

首先，将绿茶样品顶空气测试谱图数据扣除空白对照谱图数据，得到茶香VOCs组分的目标谱图数据。通过自行编写的峰面积积分软件对目标谱图进行处理，得到峰面积-质荷比数据。将各样品数据整合，通过SPSS 22.0（IBM SPSS statistics）软件对所有检出峰进行显著性筛选，再将具有显著性的质谱峰选出，通过SIMCA-P 14.1（Umea， Sweden）进行PLS-DA、HCA分析以及ROC曲线的绘制与置换检验。

3 结果与讨论

3.1 参数优化与设定

在动态顶空采样策略中，吹扫载气的流速是一个关键指标。选取4种香型等比例混合茶叶样品进行载气流速的优化，以除试剂离子外茶叶样品顶空气香味组分的总离子流信号强度作为参考。如图2所示，当载气流速为500 mL/min时信号强度达到最大值。这是两种因素共同作用的结果：一方面，吹扫载气流速的增加，可以载带出更多的茶香VOCs组分; 另一方面，过高的载气流速会对气体样品产生较大的稀释作用。因此，后续实验中均采用500 mL/min的吹扫载气流速。

此外，样品预处理方式考虑了茶叶样品的形态对茶香VOCs成分释放的影响，对茶叶样品研磨及未研磨两种方式进行对比，考察茶香的挥发性成分谱图差异。结果表明，进样研磨与未研磨绿茶样品，所得茶香VOCs成分谱图基本一致。考虑到对样品进行研磨破坏了茶叶样品的原始形态，同时增加了茶叶样品预处理的复杂程度，因此采用未研磨样品进行实验。实验中的具体参数设定见表2。

3.2 4种香型绿茶指纹特征谱图对比

按照设计的实验方法，分别采集4种不同香型绿茶挥发性茶香成分的HPPI/CI特征指纹谱图，如图3所示。对比特征谱图可知，在m/z 0～100范围内，4种不同香型绿茶的主要挥发性成分所得质谱峰的种类差别不大，主要包括m/z 33、47、51、65、73及79等信号峰，但各质谱峰所占的比例分布差别较为明显。4种香型绿茶的挥发性成分质谱（图3）中，均以m/z 51及65质谱峰的信号强度为最高。在嫩栗香型的特征谱图中，m/z 51与65质谱峰的信号强度基本一致，分别占总质谱峰信号强度的28%及27%（图3A）; 在嫩香型的特征谱图中，m/z 51的信号强度略高于m/z 65，二者占总质谱峰信号强度的比例为34%和23%（图3B）; 在栗香型的特征谱图中，m/z 51的信号强度仅占16%，m/z 65的信号占比高达51%成为主要检出峰（图3C）; 在熟栗香型的特征谱图中，则以m/z 51的信号为主，占比达到45%，而m/z 65的信号强度仅占12%（图3D）。在m/z 100～200范围内，不同香型之间挥发性成分的质谱峰强度虽然不高，但种类差异较为明显，嫩栗香型的谱图中主要包含m/z 139、141、153和157的质谱信号; 嫩香型的谱图中质谱信号明显增多且强度比例升高，包含m/z 105、119、140、153和157的质谱信号; 栗香型与熟栗香型较为类似，以m/z 105、119、149的质谱信号为主，其中栗香型谱图中m/z 141等的质谱信号更为显著。参考文献[24， 36]，部分检出物定性分析结果见表3，更多质谱峰的定性归属有待进一步研究。

3.3 多元统计数据分析

多元统计模式识别的方法能够从复杂的数据中最大限度地提取简化后的信息以供分析。本研究选用了模式识别中的PLS-DA及HCA两种处理方式，从不同角度进行分析，以相互验证仪器及分析方法的可靠性，并通过受试者工作特征曲线（Receiver operating characteristic curve， ROC）以及曲线下面积（Area under the cure ， AUC）對分类方法进行考察。

在模型建立过程中，首先构建了PCA模型观察得出4种香型具有较理想的聚类效果，但考虑到PCA虽然能够反映数据的原始形态，但不能忽略与研究目的无关的组内误差及随机误差，因而不利于准确确定组间差异。为了进一步确定组间差异，提高预测的准确度，本研究进行了PLS-DA模型建立及分析。PLS-DA是一种有监督的模式识别方法，集主成分分析、典型相关分析和多元回归分析的基本功能于一体，分析过程中可以消除众多化学信息中相互重叠的部分，使得分析数据更加准确可靠。对嫩香型、栗香型、嫩栗香型和熟栗香型4种香型分别随机提取1个样本作为模型验证组，其余共27个绿茶样本进行PLS-DA聚类分析。如图4A所示，在PLS-DA散点图中（PC1 = 0.457， PC2 = 0.178），4种香型样本分析结果在95%置信区间内存在显著差异，具有明显的组间分离以及组内聚集趋势。结果表明，4种香型的高度聚合表明同种香型的绿茶样品挥发性茶香成分自身差异较小，但不同香型之间差异明显。其中，R2X（cum）=0.734表明拟合得出的主成分涵盖了所有观测值信息的73.4%，R2Y（cum）=0.888表示模型拟合出的主成分可以解释样本所有变量的88.8%，Q2（cum）=0.851表示模型的预测能力可以达到85.1%。4种测试样本出现在相应的模型聚类区间内，表明本模型对盲样的预测能力较为准确。

HCA是一种根据数据间的相关性对分析对象进行分类分析的方法，属于模式识别中的非监督算法。为了进一步表达各种不同香型的聚散程度，对绿茶样品挥发性茶香成分质谱数据的灵敏特征区间进行系统聚类分析，得到树状分类图（图4B）。结果表明，聚类分析不仅能够将4种不同香型的茶叶样品各自区分开来，而且根据纵坐标所代表的距离系数值可以清晰显示各香型之间的亲疏关系。进一步分析可知，栗香与嫩栗香两个香型最为相似，差异最小; 而熟栗香、嫩香和栗香/嫩栗香之间的区别较为明显，说明熟栗香、嫩香和栗香/嫩栗香之间存在明显差异。HCA分析所得结果与PLS-DA结果相互补充和印证，充分说明了使用HPPI-CI-TOFMS用于绿茶香型鉴别的有效性和可靠性。

3.4 模型评估

ROC常用于反映分类器性能的优劣，AUC是其用于度量分类模型好坏的一个重要标准，AUC值一般介于0.5～1.0之间，且其值越大，表明模型的分类效果越好。图5A为经计算绘制所得的ROC曲线，其中AUC（嫩香）=1，AUC（栗香）=0.9760，AUC（嫩栗香）=0.9867，AUC（熟栗香）=1，均等于或者接近1，说明模型的分类效果理想，特异性和灵敏度均较高，本方法判别结果准确。

置换检验通常用来检验模型的有效性及是否存在算法过拟合。通过对样本进行顺序上的置换，重新计算统计检验量，构造经验分布，得到原始Y、置换Y与累积的R2和Q2之间的相关系数及回归线。其中，Q2为累积交叉有效性，R2为累计方差值，一般情况下，当R2<0.3、Q2<0.05可认为模型构建较好。如果R2和Q2两者的截距均小于模型原始值，则可认为该模型是一个优秀的模型，可用于进一步的分析处理。本研究对数据集进行200次置换检验，结果如图5B所示，得到R2截距为0.185，Q2截距为0.457。左侧的R2和Q2值均低于最右侧原始的R2和Q2值，且Q2回归线的截距为负值，说明所构建的PLS-DA判别模型没有出现过拟合现象，且具有较好的预测能力，能够用于不同类别的判别分析。

4 结 论

本研究基于动态顶空进样-高气压光电离-化学电离-飞行时间质谱仪，在线测量茶叶样品挥发性香味组分的指纹特征谱图，并结合多元统计方法，对4种不同香型绿茶样品进行了快速鉴别分析。本方法无需复杂的样品前处理，单样品分析时间仅需3 min。结果表明，高气压光电离-化学电离飞行时间质谱技术结合模式识别分类方法，可有效区分不同香型的绿茶样品，且具有较理想的预测能力，为茶叶品类鉴别提供了一种客观、快速的新方法。客观的分析能力以及快速的分析速度是方法得以推广及实际应用的重要优势，本方法能够用于食品品质分析、疾病早期筛查和环境质量分析等领域。

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