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在双波长下识别Fe3+的一种新型可视化荧光探针的合成及性能

2019-05-13刘瑞姣陈佳敏

发光学报 2019年4期
关键词:罗丹明探针乙醇

曾 竟, 刘瑞姣, 陈佳敏

(新疆师范大学 化学化工学院, 新疆 乌鲁木齐 830054)

1 引 言

过渡金属和重金属离子广泛存在于自然界中,并在生命活动中发挥着重要作用[1-3],与人类的健康密切相关。其中铁元素是人体内含量最为丰富的过渡金属元素,是人体所必需的微量元素之一。它广泛分布于人体中,几乎所有组织均含有铁。它还是血红蛋白的重要组成成分,是血液中输送氧与交换氧的重要元素,也是许多酶的组成成分和氧化还原反应酶的激活剂[4]。铁元素过量或不足对人体均有害处[5-8]。因此,寻找一种可靠的方法检测生物或环境中的Fe3+显得至关重要,Fe3+荧光探针的选择性、高灵敏性与合成也备受关注。

四苯乙烯(TPE)包含4个共轭苯环,具有独特的聚集诱导发光(AIE)行为,即在分散状态时荧光十分微弱,但在聚集状态下荧光强度急剧增大,表现出强荧光行为。自2001年唐本忠教授课题组[9]对AIE效应进行首次报道以来,人们利用四苯乙烯类化合物的AIE性质,设计并合成出大量新型荧光探针并用于金属阳离子、氰基化合物、巯基、蛋白质等的检测[10-15]。罗丹明B类有机染料为一类经典荧光母体,其螺内酰胺闭环时溶液为无色,荧光强度较弱,而罗丹明开环结构具有高摩尔吸光系数、刚性共轭结构大、发射波长长、水溶性好等优异性能[16],同时能产生明显的荧光、紫外吸收光谱变化和颜色变化。因此,开发并设计新型的高选择性和高灵敏度的罗丹明衍生物探针[17-24]仍然具有巨大的潜力。

基于上述思路,已合成报道的四苯乙烯官能团化的罗丹明亚胺化合物TPE-RhB[25]未能充分利用四苯乙烯的聚集诱导发光性质来专一性识别金属阳离子,因此本文将化合物TPE-RhB进一步还原得到新的基于四苯乙烯-罗丹明的双仲胺化合物L,以期目标化合物能同时发挥四苯乙烯类和罗丹明类化合物的优异荧光性能,在离子识别方面表现出特殊的识别能力。

2 实 验

2.1 仪器与试剂

红外光谱由Bruker TENSOR27红外光谱仪测定;核磁共振数据由美国Varian公司Varian 400-MR (TMS内标,CDCl3做溶剂)测定;紫外吸收光谱由日立U-3310紫外可见分光光度计测定;荧光光谱数据使用Varian Cary Eclipse荧光分光光度计测定;电化学性能由CHI600电化学工作站测定;熔点使用北京泰克仪器有限公司X-4显微熔点仪测定。

乙醇和四氢呋喃溶液经干燥处理后重蒸得到。实验中使用的蒸馏水均通过自动三重纯水蒸馏器(SZ-97,上海亚荣生化仪器厂)重蒸获得,其他所用试剂均为市售分析纯或化学纯。

2.2 化合物L的合成

TPE-RhB按照参考文献[25]制备且表征数据与文献一致。

L的合成路线如图1所示:向带有磁子的50 mL干燥圆底烧瓶中加入TPE-RhB(0.3 g,0.35 mmol)和10.0 mL无水乙醇,启动搅拌,待固体完全溶解后,冰浴降至0 ℃以下后,分批加入NaBH4(0.1 g,2.5 mmol),加入完毕后,缓慢回至室温,薄层色谱跟踪反应,6 h左右反应完全后用1 mol/L的HCl溶液猝灭NaBH4的活性,并用1 mol/L的NaOH溶液将体系调至中性,二氯甲烷萃取(3×30 mL)有机相,合并有机层后并用无水硫酸钠干燥,待干燥透彻后,用旋转蒸发仪减压除去溶剂,混合物用石油醚∶乙酸乙酯=8∶1(体积比)为洗脱剂柱层析分离得0.23 g黄色粉末状固体化合物L,产率 76%。m.p. 142~143 ℃;1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:1.13(s,12H),2.22(s,6H),2.78(s,4H),3.29(s,8H),4.19(s,1H),4.49(s,1H),6.25~6.26(m,4H),6.39~6.42(m,4H),6.72~7.06(m,16H),7.48~7.50(m,2H),7.90~7.92(m,1H);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ: 12.6,21.1,21.2,26.9,41.4,44.3,49.5,65.8,97.9,105.8,107.8,111.9,122.8,124.1,125.8,127.4,128.2,128.3,128.4,128.5,131.2,131.3,131.6,132.3,132.7,135.3,141.7,144.9,146.6,148.8,153.9,167.1。

图1 探针L的合成路线

3 结果与讨论

3.1 电化学性质

化合物L和内标物质二茂铁的电化学性能测试均采用循环伏安法,浓度为1×10-3mol/L,在以四丁基高氯酸铵为支持电解质(0.1 mol/L)的乙醇溶液中进行,玻碳电极为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,Pt丝为对电极,扫描速率为0.05 V/s,在氮气氛中分正负区扫描得到,扫描曲线见图2。L含有仲胺结构单元,容易被氧化而得到电子;同时含有罗丹明螺内酰胺结构,容易失去电子被还原而开环,形成氧杂蒽环结构。

从正区的CV曲线中可以得知,它氧化的起始电位为0.41 V,氧化的最大峰电位在0.69 V;根据电离式公式IP=-EHOMO=[Eonset+E(Fc/Fc+)+4.8] eV,得到L的电离势为5.77 eV,与正电极的功函数(5.5 eV)较匹配,可降低空穴注入的能垒,提高空穴注入效率,因此L还有望开发成为空穴传输材料。从负区的CV曲线可以得到还原起始电位为-0.45 V,还原峰值电位为-0.81 V;根据电子亲合能公式EA=-ELUMO=[Ered-E(Fc/Fc+)+4.8] eV,得出其电子亲合能为3.71 eV,比PBD(EA=2.82 eV)的电子亲和能大,有望开发为电子传输材料。

图2 二茂铁和L的CV曲线图

Fig.2 Cyclic voltammograms of compounds ferrocene andL

3.2 化合物L的聚集诱导荧光性质

通过荧光光谱法研究了L的聚集诱导发光性质,测试溶液浓度为50 μmol/L,具体结果如图3所示。

从图3可以看出,化合物L在水体积分数低于30%时,508 nm处荧光强度较弱;当水体积分数增加至80%时,荧光强度达到最大,为957,比纯乙醇溶液时增强478倍,说明L具有典型的聚集诱导发光性质。

图3 (a)L(50 μmol/L)在不同体积分数的乙醇/水混合溶液中聚集诱导荧光图(λex=350 nm,λem=508 nm);(b)聚集诱导荧光发射强度趋势图(插图是在可见光与365 nm紫外光下的图片)。

Fig.3 (a) Emission spectra ofL(50 μmol/L) in EtOH-H2O mixtures with different water fraction(λex=350 nm,λem=508 nm). (b) Plots of maximum emission intensity ofLversuswater fraction in the EtOH-H2O mixture(Inset: photographs of compoundLin EtOH/H2O mixtures under the visible and 365 nm ultraviolet light).

3.3 化合物L的荧光探针性能

3.3.1 最佳实验条件

为使L达到最优选择性能,首先按照标准方法配置浓度为0.05 mol/L、pH=7.3的Tris-HCl缓冲溶液,其次量取2.5 mL 5.0×10-4mol/L探针L储备液到5 mL小瓶中,并使用2.5 mL上述Tris-HCl缓冲溶液调节pH值配置得到50 μmol/L的探针L的乙醇/水(V∶V,1∶1,Tris-HCl pH=7.0)待测液,测定紫外吸收和荧光发射光谱,分别进行了pH值和时间对荧光光谱影响的研究。

3.3.1.1 pH值的影响

为了进一步探究L的实用性,本文探讨了pH值对L的影响,结果如图4所示。当pH<4时,荧光发射峰在582 nm处荧光强度随pH值减小而增大;当pH>4后,荧光强度趋于稳定。由于实际生活环境、生物体系的pH值都比较接近中性条件,因此本论文的荧光识别pH值选择为7.0。

图4 在不同pH值下探针L荧光强度的变化图(黑色曲线:λex=350 nm,λem=508 nm;红色曲线:λex=530 nm,λem=582 nm)

Fig.4 Emission intensity ofLin different pH conditions (black curve:λex=350 nm,λem=508 nm;red curve:λex=530 nm,λem=582 nm)

3.3.1.2 响应时间

为考察L对Fe3+的识别的灵敏度,在乙醇/水(V∶V,1∶1,Tris-HCl pH=7.0)体系中做了响应时间测试,测试结果如图5所示。实验结果表明15 min后荧光强度趋于稳定状态,说明络合基本完全。因此后续荧光测试选取20 min后进行测试。

图5L在乙醇/水(50 μmol/L,V∶V,1∶1,Tris-HCl pH=7.0)中的响应时间。(a)λex=350 nm,λem=508 nm;(b)λex=530 nm,λem=582 nm。

Fig.5 Emission intensity ofLin EtOH/H2O(50 μmol/L,V∶V, 1∶1, Tris-HCl pH=7.0) solution with different time conditions. (a)λex=350 nm,λem=508 nm. (b)λex=530 nm,λem=582 nm.

3.3.2L的选择性实验

在上述最优条件下,拟通过可视化识别、紫外-可见吸收光谱、荧光光谱三方面综合考察L对金属阳离子的识别能力。首先分别选取聚集诱导荧光较强的50 μmol/LL的水/乙醇(V∶V,7∶3,Tris-HCl pH=7.0)和(V∶V,6∶4,Tris-HCl pH=7.0)体系进行选择性识别研究,均未实现对某一金属阳离子的专一选择性识别。但值得庆幸的是当选择50 μmol/LL的水/乙醇(V∶V,1∶1,Tris-HCl pH=7.0)体系时,可实现对铁离子的专一性识别。

3.3.2.1 可视化识别

从可见光照射下溶液的图片(图6)可以看出,当加入Fe3+后,溶液颜色由无色变成红色,其他金属离子无明显变化。而在365 nm紫外灯照射下观察发现,当加入Fe3+后,溶液荧光强度显著降低,加入其他金属离子后溶液无明显变化,因此L可以裸眼识别铁离子。

图6 向50 μmol/L探针L的乙醇/水(V∶V,1∶1,Tris-HCl pH=7.0)中加入10 equiv.不同阳离子后,可见光(a)和365 nm紫外灯(b)下可视化识别情况。

Fig.6 Photographs of 50 μmol/LLin EtOH/H2O (V∶V, 1∶1, Tris-HCl pH=7.0) solution with the presence of various cations under the visible light(a) and UV illumination(365 nm) (b)

3.3.2.2 紫外-可见吸收光谱

从紫外-可见吸收光谱(图7)可知,当加入Fe3+后,320 nm处的吸收峰明显增强,并且在560 nm处出现一个新吸收峰,而加入其他离子和未加Fe3+的体系中未出现类似情况。因此,从紫外-可见吸收光谱图中也可看出L对Fe3+表现出专一性识别。

图7 向50 μmol/L探针L的乙醇/水(V∶V,1∶1,Tris-HCl pH=7.0)中加入10 equiv.不同金属离子后的紫外-可见吸收光谱

Fig.7 UV-Vis absorbance spectra of 50 μmol/LLin EtOH/H2O (V∶V, 1∶1, Tris-HCl pH=7.0) solution with 10 equiv. various cations

3.3.2.3 荧光光谱

荧光光谱实验结果如图8所示。未加入金属阳离子时,508 nm和582 nm处荧光发射峰强度分别为896和17;Fe3+加入后,508 nm处荧光强度急剧减弱,最大发射波长蓝移6 nm,表现为荧光猝灭,猝灭比为87.5%,实现了对Fe3+的“turn-off”识别。非常有趣的是伴随508 nm处的荧光猝灭,582 nm处荧光发射强度则急剧增大,强度较空白溶液增大45倍,对Fe3+实现了“turn-on”识别,而在相同条件下,除Al3+在582 nm处荧光发射峰强度略微增大外,其他金属离子几乎未引起荧光强度改变。因此,化合物L表现出对Fe3+特有的选择性和专一性。

从以上可见光照射下溶液的图片、紫外-可见吸收光谱和荧光光谱的实验结果可以看出,化合物L表现出对Fe3+特有的选择性和专一性,并且整个识别过程裸眼可见。

图8 向50 μmol/L探针L的乙醇/水(V∶V,1∶1,Tris-HCl pH=7.0)中加入10 equiv.不同金属离子后的荧光光谱。(a)λex=350 nm,λem=508 nm;(b)λex=530 nm,λem=582 nm。

Fig.8 Fluorescence spectra obtained for 50 μmol/LLin ethanol-water(V∶V, 1∶1, Tris-HCl pH=7.0) after the addition of 10 equiv. various cations. (a)λex=350 nm,λem=508 nm. (b)λex=530 nm,λem=582 nm.

3.3.3 金属离子竞争性实验

为了进一步探究L作为Fe3+探针的实用性,进行了10 equiv. 不同金属离子与等量Fe3+共存时的干扰实验,结果如图9所示。

图9 向50 μmol/L探针L的乙醇/水(V∶V,1∶1,Tris-HCl pH 7.0)中加入10 equiv.不同金属离子和等量Fe3+共存时的荧光强度变化图。(a)λex=350 nm,λem=508 nm;(b)λex=530 nm,λem=582 nm。

Fig.9 Emission intensity changes of 50 μmol/LLin EtOH/H2O (V∶V, 1∶1, Tris-HCl pH=7.0) solution with 10 equiv. Fe3+and other cations. (a)λex=350 nm,λem=508 nm. (b)λex=530 nm,λem=582 nm.

在其他金属离子,向L的乙醇/水(V∶V,1∶1,Tris-HCl pH=7.0)溶液加入Fe3+后,由Fe3+引起的荧光猝灭(508 nm)和荧光增强(582 nm)现象基本没有发生变化,由此说明,L对Fe3+的识别具有较强的抗干扰能力,是一种高选择性的荧光探针。

3.3.4光谱滴定实验

利用紫外和荧光滴定实验进一步研究了L对Fe3+的选择性,在50 μmol/LL的乙醇/水(V∶V,1∶1,Tris-HCl,pH=7.0)体系中不断增加Fe3+的浓度,观察探针紫外吸收强度和荧光强度的变化,结果如图10和图12。

3.3.4.1 紫外-可见吸收光谱滴定实验

紫外吸收光谱显示(图10),Fe3+浓度在0~850 μmol/L之间,随Fe3+浓度的逐渐增大,327 nm和560 nm处吸收峰均呈现递增趋势,溶液颜色呈现出由无色到粉红色变化过程。Fe3+浓度在500~700 μmol/L之间时,紫外吸收强度与铁离子浓度有较好的线性关系,相关系数为0.980 9,线性相关曲线如图11。

图10 向50 μmol/L探针L的乙醇/水(V∶V,1∶1,Tris-HCl pH=7.0)溶液中逐渐加入0~850 μmol/L Fe3+后的紫外光谱图

Fig.10 UV-Vis absorbance spectra of 50 μmol/LLin EtOH/H2O (V∶V, 1∶1, Tris-HCl pH=7.0) solution with 0~850 μmol/L Fe3+

图11 紫外吸收强度随Fe3+浓度变化的线性关系图 (λ=560 nm)

Fig.11 Linear plot ofLfor the different addition of Fe3+ions(λ=560 nm)

3.3.4.2 荧光光谱滴定实验

从图12(a)中可以看出,测试Fe3+浓度在0~700 μmol/L之间,在508 nm处的荧光强度随铁离子浓度增大而减小,最终趋于稳定。Fe3+浓度在150~450 μmol/L之间有较好线性关系(图13(a)),经过拟合得到线性回归方程y=0.927×106x+534.5,R2=0.986 6,并通过检测限公式D=3Sd/ρ(其中ρ是荧光强度与铁离子浓度的斜率,Sd是空白标准偏差)得出检测限D=4.56×10-6mol/L。

然而,L在582 nm处(图12(b))的荧光发射强度却呈现出相反的规律,荧光发射强度随铁离子浓度增加而增大,Fe3+浓度在0~800 μmol/L之间有较好线性关系(图13(b)),线性回归方程y=1.697×106x-392.4,R2=0.994 5,探针L对Fe3+的最低检测限可达7.4×10-7mol/L。

由此可见L的荧光发射和紫外吸收强度随着铁离子浓度的变化而改变,而铁离子浓度达到10 equiv. 后趋于稳定。实验结果表明L对Fe3+响应灵敏,且二者具有很好的络合作用。

图13 荧光强度随Fe3+浓度变化的线性关系图 。(a)λex=350 nm,λem=508 nm;(b)λex=530 nm,λem=582 nm。

Fig.13 Linear plot ofLfor the different addition of Fe3+ions. (a)λex=350 nm,λem=508 nm. (b)λex=530 nm,λem=582 nm.

3.3.5 Job’s曲线

为确定探针L与Fe3+之间的络合比,通过等物质的量连续变化法(Job’s plot),配制了L与铁离子总浓度为10 μmol/L的一系列溶液,L与铁离子浓度比分别为10∶0,9∶1,8∶2,7∶3,6∶4,5∶5,4∶6,3∶7,2∶8,1∶9和0∶10。将荧光发射峰定位在582 nm处测定其强度变化(图14)。

图14 探针L和Fe3+的Job’s曲线图,总浓度恒定为10 μmol/L。

Fig.14 Job’s plot ofLand Fe3+, the total concentration is 10 μmol/L(λex=530 nm,λem=582 nm).

从图14中可以看出,荧光发射峰处于582 nm、Fe3+摩尔分数为0.4时,荧光发射峰强度达到峰值。这一结果说明L和Fe3+是2∶1络合,它们通过2∶1的络合比例形成了比较稳定的络合物,同时伴随着很强的荧光。

3.3.6 核磁滴定实验

利用核磁共振氢谱滴定实验,进一步得到探针L与铁离子的络合机理,如图15。

图15 探针L在CD3OD/D2O(1∶1,V∶V)中加入Fe3+(a. 0.0 equiv., b. 1 equiv.) 的1H NMR谱

Fig.151H NMR of probeLin CD3OD/D2O(1∶1,V∶V) upon addition of Fe3+(a. 0.0 equiv., b. 1 equiv.)

由图15可以看出,L化学位移在(6.2~6.7)×10-6处有两组峰,它们应归属为罗丹明结构中与氧杂环相连的芳氢质子信号峰。当加入1 equiv. Fe3+后,上述两组峰消失,产生这种现象的原因是由于Fe3+加入诱导罗丹明螺旋内酰胺结构开环与氧杂环的芳环结构改变。

3.3.7 扫描电镜实验

为充分了解Fe3+与L的络合机理,在50 μmol/LL的乙醇/水(V∶V,1∶1, Tris-HCl pH=7.0)体系中进行了扫描电镜实验,从图16可以看到,探针分子L未与Fe3+络合时,分子处于聚集状态;当探针分子与Fe3+络合后,分子由聚集状态转变为分散的状态。

根据上述UV光谱、FL光谱、1H NMR滴定和扫描电镜结果分析,L由聚集状态转变为小颗粒分散态后,溶解度增大,导致508 nm处的荧光强度明显减弱,荧光发生猝灭。而罗丹明环上氮原子与Fe3+进行配位络合后,诱导螺内酰胺结构开环,形成了氧杂蒽环结构,共轭结构增大,使得在320 nm处紫外吸收强度随铁离子浓度增加而增大,并且在560 nm处出现一个新的吸收峰;同时由于罗丹明螺环内酰胺结构处于开环状态,导致582 nm处荧光发射强度大幅增大。因此推测探针L与Fe3+的可能络合模式如图17所示。

图16 探针L在乙醇-水混合溶液中形成聚集体(a)和加入10 equiv. Fe3+后(b)的SEM图

Fig.16 SEM images ofL((a)fw=50%) andLafter addition of 10.0 equiv. Fe3+(b) in ethanol-water(50 μmol/L, 1∶1,V∶V)

图17 探针L与Fe3+可能的络合机理

4 结 论

通过对化合物TPE-RhB进一步还原得到一种新型的荧光探针L,并确定了分子结构,研究了该化合物的光电性质。实验结果表明:化合物L在乙醇/水的混合溶剂中具有典型的聚集诱导发光性质;在两个不同荧光发射波长下分别实现了对Fe3+的“turn-off”和“turn-on”识别,可以作为一种具有高灵敏性和专一选择性的可视化Fe3+荧光探针,探针L与Fe3+配位比为2∶1。探针L水溶性良好,可以在乙醇/水(V∶V,1∶1,Tris-HCl,pH 7.0)体系中使用,使其在生物体系、环境水中检测Fe3+含量方面具有潜在应用价值。该化合物的电子亲合势较大,电离势为5.77 eV,与正电极的功函数(5.5 eV)较接近,有望开发为性能优良的空穴传输材料、电子传输材料等。

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