自噬对孤独症大鼠海马组织兴奋性、抑制性突触相关蛋白表达的影响及机制

罗瑜平，文敏，熊江福，周波，艾戎，童雪涛

(1贵州医科大学，贵阳550004；2贵州医科大学附属医院)

孤独症是一种异质性综合征，主要表现为社交互动、语言和兴趣范围的三个核心行为障碍[1]。目前，孤独症的病因和发病机制尚未完全阐明，大量研究发现孤独症发病与突触功能障碍有关[2]。突触功能的维持需要一定的兴奋性与抑制性回路的平衡，海马中兴奋性与抑制性突触失衡与神经发育障碍疾病相关，如孤独症、精神分裂症等[3]。早期在孤独症中发现，神经元过度兴奋和γ-氨基丁酸(GABA)能信号传导减弱，即兴奋性突触聚集、抑制性突触减少，出现兴奋性与抑制性突触失衡[4]。研究发现，自噬参与突触形成及突触连接间的建立[5]。增强自噬可促进神经系统中异常蛋白质聚集的消除[6]。自噬的增强可改善孤独症症状[7]。因此我们假设，孤独症大鼠海马组织中兴奋性、抑制性突触蛋白失衡，自噬可通过影响兴奋性、抑制性突触蛋白的表达，恢复海马组织中兴奋性、抑制性突触失衡，改善孤独症症状。2017年3月～2018年6月，我们检测了自噬干预前后孤独症大鼠海马组织突触素(Syn)、兴奋性突触[突触后致密蛋白95(PSD-95)]和抑制性突触[桥尾蛋白(Gephyrin)]的表达变化，探讨自噬对孤独症大鼠海马组织兴奋性、抑制性突触相关蛋白表达的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 健康繁殖期Wistar雌鼠20只(体质量250～260 g)和雄鼠10只(体质量270～280 g)，由贵州医科大学实验动物中心提供。丙戊酸(VPA)(P4543)购自美国Sigma公司；雷帕霉素(R-5000)购自上海睿铂赛生物科技有限公司；3-甲基腺嘌呤(3-MA)(HY-19312)购自MCE公司；(BCA)蛋白质定量试剂盒、RIPA裂解液、β-actin兔抗鼠多克隆抗体(bs-0061R)均购自北京博奥森生物技术有限公司；Syn兔单克隆抗体(BM4152)购自武汉博士德生物技术公司，PSD-95兔多克隆抗体(#3409)购自美国CST公司，Gephyrin兔单克隆抗体(EPR12650)购自美国Abcam公司。

1.2 孤独症模型建立 参考Schneider等[8]建模方法，取20只雌鼠和10只雄鼠，晚7时将雌雄鼠按2∶1的比例合笼过夜，实验动物用苦味酸标记。第2天早晨对雌鼠的阴道涂片观察，如受精则标记为妊娠(E)第1天(E1)。在E12.5时，取10只孕鼠给予250 g/L的VPA(600 mg/kg)腹腔注射，产下的后代鼠作为VPA干预组；另取5只孕鼠同时点通过腹腔注射等剂量生理盐水，产下的后代鼠作为对照组。取生后第7～10天的后代鼠行负向性实验，示VPA干预组后代鼠的方向感及运动机能总体低于对照组后代鼠，表明孤独症模型建立成功。

1.3 动物分组及干预方法 以后代鼠出生当天为生后第1天(P1)，于P35时，从VPA干预组中随机取30只分为模型组、自噬抑制组(3-MA组)和自噬增强组(Rap组)，每组各10只，分别一次性腹腔注射生理盐水、3-MA 5 mg/kg和雷帕霉素5 mg/kg；同时，对照组后代鼠10只腹腔注射同等剂量生理盐水。

1.4 刻板重复行为评价 采用自梳理实验。P42时，将每组大鼠置于标准鼠盒(30 cm×25 cm×20 cm)中，盒底于1 cm敷料覆盖，以阻止大鼠挖掘盒底。大鼠在盒内适应5 min后，观察大鼠的行为；用秒表计数10 min内自身梳理各个部位的总时间(以下简称为梳理时间)，评价大鼠的刻板重复行为。

1.5 社交能力评价 采用三箱实验。自制木箱120 cm×45 cm×50 cm，木箱中间由两块板隔开，中间格长度为60 cm，每边长30 cm。两块板下方均有一个开口，允许实验鼠自由通过。分为三个步骤(每个阶段记录10 min)：①P42时，将测试大鼠放入笼中，允许自由通过每个格子；②前10 min：将同一性别的未与测试大鼠接触的陌生鼠1引入其中一个侧室，另一个侧室则为空鼠笼；③后10 min：陌生鼠1仍然在笼子的一侧，笼子的另一侧是一只新的不熟悉的大鼠(陌生鼠2)。在其他环境条件一致的情况下，记录大鼠前后10 min分别在不同格子的停留时间，评价大鼠的社交能力，其中前10 min是社交测试，后10 min是对新鲜事物的好奇行为测试。

1.6 海马组织病理改变观察 采用HE染色法。P42时处死大鼠，取各组海马组织，脱水、石蜡包埋，冠状切片后在显微镜下观察海马组织病理改变。

1.7 海马组织Syn、PSD-95、Gephyrin蛋白表达检测 ①采用免疫组化法检测。取各组海马组织，脱水、石蜡包埋，免疫组化可见阳性细胞的细胞膜染成棕色，采用阳性细胞百分比与染色强度相结合计算积分，对免疫组化结果进行评判[9]。②采用Western blotting法进行蛋白半定量检测。P42时，将各组大鼠在冰上断颈处死，迅速取海马组织，称重后放入EP管中，加入RIPA裂解液后提取蛋白。测总蛋白浓度，取40 μg总蛋白样品于10%十二烷基硫酸钠-聚炳烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，半干转方法将蛋白转到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h后，再加一抗4 ℃过夜(Syn兔抗鼠单克隆抗体1∶500、PSD-95兔抗鼠多克隆抗体1∶1 000、Gephyrin兔抗鼠单克隆抗体1∶2 000、β-actin兔抗鼠多克隆抗体1∶2 000)；次日用TBST洗膜，再加二抗(山羊抗兔IgG 1∶10 000)室温孵育1.5 h，再用TBST洗膜，ECL发光液曝光，用Image J软件进行半定量分析。计算PSD-95/Gephyrin比值。

2 结果

2.1 各组刻板重复行为比较 对照组、模型组、3-MA组、Rap组梳理时间分别为(28.40±9.41)、(49.70±10.29)、(71.40±11.44)、(30.50±9.01)s，模型组梳理时间长于对照组，3-MA组梳理时间长于模型组，Rap组梳理时间短于3-MA组(P均<0.01)。

2.2 各组社交能力比较

2.2.1 社交测试结果 前10 min，与对照组相比，模型组在放有陌生鼠1的格子中停留时间缩短，而在放有空鼠笼的格子中停留时间延长(P均<0.05)。与模型组相比，3-MA组在陌生鼠1的格子中停留时间缩短(P<0.05)，而与在空鼠笼的格子中停留时间差异无统计学意义(P>0.05)；Rap组在陌生鼠1的格子中停留时间延长，在空鼠笼的格子中停留时间缩短(P均<0.05)。见表1。

2.2.2 好奇行为测试结果 后10 min，与对照组相比，模型组在放有陌生鼠1的格子中停留时间延长，而在放有陌生鼠2的格子中停留时间缩短(P均<0.05)。与模型组相比，3-MA组在陌生鼠1的格子中停留时间延长，在陌生鼠2的格子中停留时间缩短(P均<0.05)；Rap组在陌生鼠1的格子中停留时间缩短，在陌生鼠2的格子中停留时间延长(P均<0.05)。 见表1。

表1 各组社交能力测试停留时间比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.3 各组海马组织病理改变 HE染色示，对照组海马组织CA1区神经元排列整齐、密集，形态正常；模型组海马组织CA1区神经元排列紊乱，出现核固缩，神经细胞数量减少；3MA组、RAP组可见海马组织CA1区上散在核固缩，有不同程度的神经细胞变性。见图1。

注：a为对照组，b为模型组，c为3-MA组，d为Rap组。

2.4 各组海马组织Syn、PSD-95、Gephyrin蛋白表达比较

2.4.1 免疫组化法结果 与对照组相比，模型组Syn、PSD-95阳性细胞数增加，Gephyrin阳性细胞数减少(P均<0.05)。与模型组相比，Rap组Syn、PSD-95阳性细胞数减少，Gephyrin阳性细胞数增加(P均<0.05)；3-MA组Syn、PSD-95阳性细胞数增加，Gephyrin阳性细胞数减少(P均<0.05)。见表2、图2～4。

2.4.2 Western blotting法结果 与对照组相比，模型组海马Syn、PSD-95蛋白表达均上调，Gephyrin蛋白表达下调(P均<0.05)；与模型组相比，3-MA组Syn、PSD-95蛋白表达均上调，Gephyrin蛋白表达下调(P均<0.05)；与模型组相比，Rap组Syn、PSD-95蛋白表达均下调，Gephyrin蛋白表达水平上调(P均<0.05)。见图5～7。

表2 各组海马组织Syn、PSD-95、Gephyrin蛋白表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

注：a为对照组，b为模型组，c为3-MA组，d为Rap组。箭头示阳性细胞。

注：a为对照组，b为模型组，c为3-MA组，d为Rap组。箭头示阳性细胞。

注：a为对照组，b为模型组，c为3-MA组，d为Rap组。箭头示阳性细胞。

2.5 各组海马组织PSD-95/Gephyrin比值比较 与对照组相比，模型组PSD-95/Gephyrin比值上调；与模型组相比，3-MA组PSD-95/Gephyrin比值上调；与模型组相比，Rap组PSD-95/Gephyrin比值下调(P均<0.05)。见图8。

3 讨论

目前普遍认为，发育过程中神经系统的兴奋与抑制过程功能失调与孤独症有关[10]。大脑正常的发育需要一定水平的抑制，如果抑制功能丧失将导致孤独症[11]。突触是连接和传递神经元之间或神经元和效应细胞之间的特化结构，大脑功能的正常发挥基于其结构及数量的完整性。研究发现，孤独症儿童大脑内存在过多的突触，一旦用药物消除这些突触，可改善孤独症行为。Lo等[12]研究表明，兴奋性/抑制性回路失衡影响突触功能是导致孤独症发病的重要原因之一，因此恢复兴奋性/抑制性突触失衡对改善孤独症症状至关重要。

注：左图为Western blotting法蛋白表达条带图。右图为各组比较结果，*为与对照组比较，P<0.05；#为与模型组比较，P<0.05。

注：左图为Western blotting法蛋白表达条带图。右图为各组比较结果，*为与对照组比较，P<0.05；#为与模型组比较，P<0.05。

注：左图为Western blotting法蛋白表达条带图。右图为各组比较结果，*为与对照组比较，P<0.05；#为与模型组比较，P<0.05。

VPA是作为一种抗癫痫药在临床中运用[13]。怀孕期间暴露于VPA已被证明会增加儿童孤独症的风险，此外，产前暴露于该药物的啮齿动物显示出人类孤独症样行为表型特征，可能与破坏胚胎大脑发育的时空窗口相关[14]。因此，本研究参考Schneider等[8]的建模方法，采用VPA进行孤独症建模。本研究发现，与对照组相比，模型组大鼠自梳理时间延长，前10 min模型组大鼠在放有陌生鼠1中停留时间较对照组缩短，后10 min在放有陌生鼠2中停留时间也较对照组缩短，表明孤独症大鼠出现重复刻板行为及社交能力障碍；模型组海马CA1区神经元排列紊乱，出现核固缩，神经细胞数量减少，表明孤独症大鼠中神经细胞结构被破坏，可能与孤独症发病相关。

自噬相关通路被异常诱导，导致自噬活性降低，与孤独症相关，雷帕霉素通过抑制异常激活的自噬相关通路，增强自噬可恢复部分孤独症样行为[15]。本研究发现，与模型组相比，3-MA组梳理时间延长，前10 min 3-MA组大鼠在放有陌生鼠1中停留时间较模型组缩短，后10 min在放有陌生鼠2中停留时间也较模型组缩短，提示抑制自噬可加重重复刻板行为及社交能力障碍；与模型组相比，Rap组梳理时间缩短，前10 min Rap组大鼠在放有陌生鼠1中停留时间较模型组延长，后10 min在放有陌生鼠2中停留时间也较模型组延长，提示增强自噬会减轻重复刻板行为及社交能力障碍。

研究发现，自噬可通过调节蛋白酶体介导的降解途径调控突触生长及功能[16]。突触相关蛋白表达异常可通过自噬途径降解。突触包含Syn、兴奋性突触PSD-95和抑制性突触Gephyrin等。Syn是一种位于突触囊泡膜上的突触蛋白，主要用于反映突触的数量。PSD-95是在谷氨酸能神经元PSD中发现的兴奋性突触后膜上脚手架蛋白，只分布于突触后膜下方的突触活性区中，是突触后的标记分子，参与调节兴奋性和抑制性突触的平衡[17]。研究发现，PSD-95发育和功能异常可导致多种神经精神疾病包括智力低下、自闭症、精神分裂症和神经变性病等。Gephyrin是一种突触后支架蛋白，对抑制性突触中甘氨酸和γ-氨基丁酸A型受体的聚集至关重要，Gephyrin基因的缺失会导致包括自闭症谱系障碍、精神分裂症和癫痫发作在内的神经发育障碍性疾病，可能与扰乱了海马神经元中抑制性突触的正常的聚集相关[18]。

研究发现，增强自噬可促进对Syn的降解，恢复合成与降解间动态平衡。PSD-95的降解导致了突触的消失，而清除过剩的PSD-95有利于改善孤独症症状[19]。并且抑制性突触的减少可通过增强自噬来逆转[20]，进一步恢复兴奋性/抑制性突触的平衡。本研究发现，与对照组相比，模型组海马Syn、PSD-95蛋白表达及阳性细胞数均增加，Gephyrin蛋白表达及阳性细胞数均降低，且PSD-95/Gephyrin比值上调，提示孤独症大鼠海马组织中兴奋性突触增加、抑制性突触减少，兴奋性/抑制性突触失衡；与模型组相比，3-MA组Syn、PSD-95蛋白表达及阳性细胞数均增加，Gephyrin蛋白表达及阳性细胞数均降低，且PSD-95/Gephyrin比值上调，提示抑制自噬可进一步促进海马组织中兴奋性突触增加、抑制性突触减少，加重兴奋性/抑制性突触失衡；与模型组相比，Rap组Syn、PSD-95蛋白表达及阳性细胞数均降低，Gephyrin蛋白表达及阳性细胞数均增加，且PSD-95/Gephyrin比值下调，提示增强自噬可使海马组织中兴奋性突触减少、抑制性突触增加，恢复兴奋性/抑制性突触的失衡。以上结果表明，孤独症大鼠中兴奋性突触上调、抑制性突触下调，兴奋性/抑制性突触失衡；当增强自噬时，恢复了兴奋性/抑制性突触的平衡，改善了孤独症症状，表明兴奋性/抑制性突触失衡与孤独症发病相关。

综上所述，自噬影响孤独症大鼠的社会行为，孤独症大鼠存在兴奋性/抑制性突触失衡，增强自噬可恢复孤独症大鼠兴奋性/抑制性突触失衡，从而改善孤独症症状。