HO-3867对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及机制

曹亮，周艳，刘寒旸，耿翔，魏忆，陈帅，汤黎明

(南京医科大学附属常州二院，江苏常州213003)

胃癌是常见的恶性肿瘤之一，病死率在各种恶性肿瘤中排第三位[1]，严重威胁人类生命健康。胃癌的发生、发展及转归是个复杂、多基因、多因素参与的过程，其发病机制尚未完全明确，越来越多的学者关注胃癌的治疗和预后。干预胃癌的增殖、侵袭、转移和促进其凋亡是胃癌治疗的突破点。HO-3867是一种新型合成的二芳基烯基哌啶酮(DAP)化合物，是一种姜黄素类似物，也是信号转导与转录活化因子3(STAT3)选择性抑制剂。研究表明，HO-3867对多种肿瘤细胞具有抑制增殖、迁移、侵袭和促进凋亡的作用，如卵巢癌[2]、子宫内膜癌[3]、胰腺癌[4]等，具有良好的抗肿瘤特性。然而，目前尚未有HO-3867对人胃癌细胞增殖、迁移和侵袭作用的报道。2017年12月～2018年8月，我们通过体外培养胃癌细胞株MGC-803，观察HO-3867对MGC-803细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响，并探讨其作用机制，旨在为胃癌的治疗提供更多的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 胃癌细胞株MGC-803购自上海中国科学院细胞库。1640培养基、胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司；HO-3867购自MCE公司；细胞计数试剂盒 8(CCK-8)购自日本Dojndo公司；Transwell小室购自BD公司；抗第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)、p-PTEN、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)抗体购自Cell Signaling Technology公司；抗GAPDH、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bax)抗体购自Abcam公司；辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG二抗、BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液、PMSF、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所。

1.2 细胞培养 胃癌细胞株MGC-803在含10%FBS、1%青霉素(1×105U/L)和氯霉素(100 mg/L)的1640培养基中培养，至对数生长期，接种于10 cm培养皿中培养，置于37 ℃、5% CO2培养箱，孵育细胞，每天换一次培养基液，每两天按3∶1传代。

1.3 HO-3867剂量的确定 取对数生长期的细胞，以5×103/孔接种至96孔板，每组设置5个复孔，分别以1、2、4、6、8 μmol/L的HO-3867处理细胞，同时设置阴性对照孔(以等量血清培养基培养)，培养24 h后每孔中加入10 μL CCK-8试剂，孵育1 h，用酶标仪检测细胞增殖能力。发现HO-3867浓度为1 μmol/L时，对细胞增殖没有明显影响；HO-3867浓度为8 μmol/L时，则引起细胞死亡；浓度为2、4、6 μmol/L时，细胞存活并出现不同的抑制增殖反应。因此选用2、4、6 μmol/L浓度进行后续实验。

1.4 分组方法 将细胞分为HO-3867低剂量组、HO-3867中剂量组、HO-3867高剂量组以及未给药的空白对照组，根据检测方法设立相应的细胞浓度。

1.5 检测指标

1.5.1 细胞增殖能力 采用细胞增殖实验。将对数生长期的各组细胞，以5×103/孔接种至96孔板，每组设置5个复孔。HO-3867低、中、高剂量组分别以2、4、6 μmol/L的HO-3867处理细胞，空白对照组以等量血清培养基培养，培养24 h 后每孔中加入CCK-8试剂10 μL，孵育1 h，用酶标仪检测细胞活力值。实验重复3次。

1.5.2 细胞克隆形成能力 采用细胞克隆形成实验。HO-3867低、中、高剂量组分别以2、4、6 μmol/L的HO-3867处理细胞24 h，空白对照组以等量血清培养基培养。用胰酶消化后进行计数，每个培养皿种入200个细胞，置于37 ℃、5% CO2培养箱中，培养2周后，PBS清洗2次，甲醛固定，GIMSA染色后显微镜下拍照，观察细胞克隆形成数。实验重复3次。

1.5.3 细胞迁移能力 采用细胞迁移实验。将对数生长期的各组细胞，以2×105/孔接种至6孔板，HO-3867低、中、高剂量组分别以2、4、6 μmol/L的HO-3867处理细胞，空白对照组以等量血清培养基培养。处理24 h后消化收集细胞，以5 000个/孔接种至Transwell小室内，小室上侧为无血清培养液，下侧为含20%FBS的培养液，48 h后用0.1%结晶紫染色，用湿棉签擦去未发生迁移的细胞，然后显微镜下观察拍照，取5个高倍镜视野，观察迁移穿膜细胞数量。重复3次实验。

1.5.4 细胞侵袭能力 采用细胞侵袭实验。用冷的无血清1640培养液与MatrigeITM胶以6∶1比例稀释为凝胶，取100 μL加入Transwell小室中构建细胞体外侵袭模型。将对数生长期的各组细胞以2×105/孔接种至6孔板，HO-3867低、中、高剂量组分别以2、4、6 μmol/L的HO-3867处理细胞，空白对照组以等量血清培养基培养。消化收集各孔细胞，以2×105/孔接种至Transwell小室内，小室上侧为无血清培养液，下侧为含20%FBS的培养液，48 h后用0.1%结晶紫染色，用湿棉签擦去未发生侵袭的细胞，显微镜下观察拍照，取5个高倍镜视野，观察侵袭穿膜细胞数量。重复3次实验。

1.5.5 细胞凋亡情况 采用细胞凋亡实验。将对数生长期的各组细胞，以2×105/孔接种至6孔板，HO-3867低、中、高剂量组分别以2、4、6 μmol/L的HO-3867处理细胞24 h，空白对照组以等量血清培养基培养。消化收集各孔细胞，按照说明书进行AnnexinV及PI双染色，上机检测，观察晚期凋亡(Q2)和早期凋亡(Q3)细胞的总凋亡数所占百分比计算总凋亡率。重复3次实验。

1.5.6 抑癌基因PTEN蛋白表达 采用Western blotting法检测抑癌基因PTEN蛋白的表达以及活化状态的p-PTEN水平。按照蛋白提取步骤提取各组总蛋白，用BCA法测定总蛋白浓度，经SDS-PAGE点用后转移到NC膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST洗涤后，分别加入1∶1 000抗PTEN、p-PTEN、GAPDH抗体，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤后加入1∶5 000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h，再用TBST洗涤，化学发光并曝光成像。

1.5.7 细胞迁移、凋亡相关蛋白表达 采用Western blotting法检测。提取总蛋白后，同上法检测迁移相关蛋白MMP-9、MMP-2及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。

2 结果

2.1 各组细胞增殖能力比较 HO-3867低、中、高剂量组细胞活力值均低于空白对照组(P均<0.05)，且HO-3867剂量较高组的细胞活力值低于HO-3867剂量较低组(P均<0.05),见图1。

注： *为P<0.001。

2.2 各组细胞克隆形成能力变化 空白对照组、HO-3867低剂量组、HO-3867中剂量组、HO-3867高剂量组细胞克隆形成数分别为(137.0±22.6)、(88.3±11.0)、(57±10.8)、(35.3±11.7)个，HO-3867低、中、高剂量组细胞克隆形成数均少于空白对照组(P均<0.05)，且HO-3867剂量较高组的细胞克隆形成数较少(P均<0.05)。见图2。

注：A为空白对照组；B为HO-3867低剂量组；C为HO-3867中剂量组；D为HO-3867高剂量组。

2.3 各组细胞迁移、侵袭能力比较 HO-3867低、中、高剂量组侵袭、迁移穿膜细胞数均少于空白对照组(P均<0.05)，且HO-3867剂量较高组的侵袭、迁移穿膜细胞数少于HO-3867剂量较低组(P均<0.05)，见表1。

表1 各组细胞迁移和侵袭细胞数比较(个,

注：与空白对照组相比，*P<0.05；与HO-3867低剂量组比较，#P< 0.05；与HO-3867中剂量组比较，&P<0.05。

2.4 各组细胞凋亡情况比较 空白对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组细胞的总凋亡率分别为1.43%±0.33%、4.55%±0.38%、5.64%±0.17%、8.56%±0.92%，HO-3867低、中、高剂量组总凋亡率均高于空白对照组(P均<0.05)，见图3。

2.5 各组迁移及凋亡相关蛋白表达比较 HO-3867低、中、高剂量组MMP-2、MMP-9、Bcl-2 蛋白表达均低于空白对照组(P均<0.05)，且HO-3867剂量较高组MMP-2、MMP-9蛋白表达低于HO-3867剂量较低组(P均<0.05)。HO-3867低、中、高剂量组Bax蛋白表达均高于空白对照组(P均<0.05)，且HO-3867剂量较高组Bax蛋白表达高于HO-3867剂量较低组(P均<0.05)。见表2。

注：A为空白对照组；B为HO-3867低剂量组；C为HO-3867中剂量组；D为HO-3867高剂量组。

2.6 各组细胞PTEN、p-PTEN蛋白表达比较 HO-3867低、中、高剂量组PTEN、p-PTEN蛋白表达均高于空白对照组(P均<0.05)，且HO-3867剂量较高组PTEN、p-PTEN蛋白表达高于HO-3867剂量较低组(P均<0.05)。见表3。

表2 各组MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax蛋白表达比较

注：与空白对照组相比，*P<0.05；与低剂量组比较，#P<0.05；与中剂量组比较，&P<0.05。

表3 各组PTEN、p-PTEN蛋白表达比较

注：与空白对照组相比，*P<0.05；与低剂量组比较，#P<0.05；与中剂量组比较，&P<0.05。

3 讨论

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，而且其早期诊断率低、发现时多已发生淋巴及远处转移，常常在患者就诊时就已经失去了根治性手术的机会，目前尚无对胃癌疗效好、不良反应小的治疗药物。HO-3867是二芳基哌啶酮(DAP)化合物，是姜黄素类似物的一种，是通过将哌啶酮连接到β-二酮结构和取代苯基上的氟而得到的。HO-3867的化学设计包括添加两个特定的基团，一个氮氧基团和一个羟胺基团。这些基团有助于化合物的活化，特别是在癌细胞富含氧化还原的环境中，使其成为还原的氮氧化合物[5]。研究表明，HO-3867能抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭，并选择性地对癌细胞有毒性作用，诱导癌细胞凋亡[6～8]。Tierne等[3]研究表明，HO-3867可上调P53蛋白表达以及下调Bcl-2、Bcl-xL、Caspase-3、Caspase-7和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)蛋白表达，诱导子宫内膜癌细胞G2/M阻滞。另外，Hu等[4]研究发现，HO-3867能通过活性氧依赖性内质网应激诱导胰腺癌细胞凋亡。然而，目前尚无HO-3867在胃癌中作用的报道。

增殖、凋亡、侵袭和迁移是恶性肿瘤细胞基本特征，与肿瘤发生和发展密切相关，能否抑制胃癌细胞增殖、侵袭和迁移和诱导其凋亡，是HO-3867抗胃癌的关键。因此本研究用HO-3867处理胃癌细胞MGC-803后，观察其增殖、凋亡、侵袭和迁移功能改变，探讨HO-3867是否具有抗胃癌的作用。本研究发现，HO-3867低、中、高剂量组细胞活力值均低于空白对照组，提示用HO-3867处理细胞后，MGC-803细胞增殖能力明显降低；HO-3867低、中、高剂量组细胞克隆形成数少于空白对照组，提示HO-3867可明显抑制胃癌细胞克隆形成能力；HO-3867低、中、高剂量组侵袭、迁移穿膜细胞数均少于空白对照组，提示HO-3867可明显抑制胃癌细胞的侵袭、迁移能力；HO-3867低、中、高剂量组总凋亡率均高于空白对照组，提示HO-3867能明显促进胃癌细胞凋亡，以上结果表明，HO-3867具有抑制胃癌细胞MGC-803增殖、侵袭和迁移并促进其凋亡的能力。

胃癌的发生发展与肿瘤迁移和侵袭密切相关。基质金属蛋白酶(MMPs)是蛋白水解酶中的一种，能够降解细胞外基质，在肿瘤细胞的侵袭和迁移的过程中起着重要作用。MMP-2、MMP-9蛋白是MMPs家族中重要成员，在多种肿瘤中表达上调，参与肿瘤的浸润和转移过程[9,10]。本研究发现，HO-3867低、中、高剂量组MMP-2、MMP-9、Bcl-2 蛋白表达均低于空白对照组，表明HO-3867抑制MGC-803细胞的侵袭和迁移能力可能是通过下调MMP-9、MMP-2蛋白表达实现的。

凋亡是细胞自然死亡的过程，在肿瘤细胞的生物学行为中起着重要的作用[11]。因此诱导胃癌凋亡是抗胃癌的重要途经。Bcl-2和Bax是经典的抑制凋亡和促进凋亡基因，两者构成比是凋亡调控的关键因素。Bcl-2过表达与Bax形成异源二聚体抑制细胞凋亡，Bax过表达与Bcl-2 构成同源二聚体促进细胞凋亡[12]。本研究发现，HO-3867低、中、高剂量组Bcl-2蛋白表达均低于空白对照组，Bax蛋白表达均高于空白对照组，提示HO-3867可促进胃癌细胞凋亡，推测HO-3867可能通过调节Bcl-2和Bax蛋白水平来诱导胃癌细胞MGC-803凋亡。

PTEN是张力蛋白同源磷酸酶基因，位于染色体10q23.31，能编码具有磷脂和蛋白质双重磷脂酶活性的蛋白，即为PTEN蛋白[13]。PTEN在多种癌症中表达缺失或低表达，是一个抑癌基因，被认为与癌症的进展密切相关[14]。在多项研究结果显示，PTEN对STAT3具有负性调节作用，抑制肿瘤生长和转移，促进肿瘤细胞凋亡[15,16]。而HO-3867是STAT3选择性抑制剂，HO-3867是否能通过调节PTEN来调节胃癌细胞增殖、凋亡以及迁移和侵袭功能尚不明确。本研究发现，与空白对照组相比，HO-3867处理后的MGC-803细胞中PTEN、p-PTEN蛋白水平明显上调，表明HO-3867可上调PTEN基因的表达并促进PTEN磷酸化活化，可能是其抑制胃癌细胞MGC-803的增殖能力、迁移和侵袭，并诱导胃癌细胞凋亡的机制之一。

综上所述，HO-3867能抑制胃癌细胞株MGC-3867的增殖、克隆形成、侵袭和迁移，并促进其凋亡，其机制可能是通过调节PTEN、Bcl-2、Bax、MMP-2以及MMP-9等基因表达来发挥作用的，这可能为胃癌治疗提供新的依据。但HO-3867对于胃癌的具体作用机制尚未完全明确，未来尚需要更深入的研究。