响应面法优化核桃油复合抗氧化剂的研究

卢付青，游敬刚，潘红梅，吴 斌，唐蜀智，李益恩，黄 静，邓 楷，罗 丹

(1.四川省食品发酵工业研究设计院，成都 611130； 2.四川省林业科学研究院，成都 610081；3.绵阳德生皇食品有限责任公司，四川 绵阳 621000)

核桃油含有高达90%左右的不饱和脂肪酸，有利于降低人体胆固醇和防止动脉硬化，其含有的亚油酸是人体必需脂肪酸，具有多种保健功能。然而，由于核桃油富含不饱和脂肪酸，其在加工储存过程中易发生氧化酸败，严重影响其食用品质，并降低储存期。

抗氧化剂广泛用于油脂行业以延长油脂保质期。李书国等[1]研究发现特丁基对苯二酚(TBHQ)、没食子酸丙酯(PG)、2,6-二叔丁基对甲苯酚(BHT)均可不同程度地延长核桃油的货架期。牛艳等[2]研究发现，空气、水分和光照等因素对亚麻籽油的过氧化值产生较大影响，而抑制亚麻籽油氧化最常用的方法是添加抗氧化剂。陈杰等[3]利用Schaal烘箱法研究抗氧化剂对亚麻籽油货架期的影响，得出TBHQ可延长亚麻籽油货架期12个月。采用响应面分析法筛选核桃油最优复配抗氧化剂和增效剂的研究尚未见报道。本文主要以抗氧化剂TBHQ、丁基羟基茴香醚(BHA)和BHT及增效剂柠檬酸、抗坏血酸为研究对象，通过单一和复配试验、响应面优化试验，以过氧化值为评价指标，筛选出核桃油最优抗氧化剂，以期为工业化生产中延长核桃油货架期提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

核桃油,绵阳德生皇食品有限责任公司；TBHQ、BHT、BHA、柠檬酸、抗坏血酸(食品级)均为市售。

冰乙酸、三氯甲烷、碘化钾、硫代硫酸钠、石油醚(沸程30～60℃)、可溶性淀粉均为分析纯；重铬酸钾为工作基准试剂,成都科龙化学试剂厂。

FA2004N电子天平，DHG-9240智能型恒温鼓风干燥箱。

1.2 试验方法

1.2.1 加速氧化试验

采用Schaal烘箱法[4-5]。将核桃油样品盛放于广口瓶中，在60℃恒温烘箱中加热以加速氧化，每隔24 h测其过氧化值，直至超过核桃油国标(GB/T 22327—2008)限值6 mmol/kg。

1.2.2 单一和复合抗氧化剂试验

将0.02%TBHQ、0.02%BHT、0.02%BHA和总量不超过0.02%TBHQ、BHT、BHA任意组合，分别加入200 g核桃油中溶解，以未添加抗氧化剂的油样作空白对照，按1.2.1方法进行加速氧化试验，研究单一和复合抗氧化剂对核桃油的抗氧化效果，以筛选最优抗氧化剂。

1.2.3 最优抗氧化剂与增效剂复配试验

将1.2.2筛选的最优复合抗氧化剂分别与柠檬酸、抗坏血酸复配使用，以未添加增效剂的油样为对照，按1.2.1方法进行加速氧化试验。研究复合抗氧化剂与增效剂复配对核桃油的抗氧化效果。

1.2.4 过氧化值测定

按照GB 5009.227—2016中第一法(滴定法)进行测定。

1.2.5 数据处理与分析

试验数据均为3次重复，测定结果表示为“平均值±标准差”。采用Excel，Design-Expert 8.0.7和SPSS21.0等软件进行数据处理分析和作图。

2 结果与分析

2.1 单一和复合抗氧化剂试验

2.1.1 单一抗氧化剂试验(见图1)

图1 单一抗氧化剂对核桃油过氧化值的影响

由图1可知，随加热时间的延长，核桃油过氧化值均逐渐升高，3种抗氧化剂对核桃油的抗氧化效果不同。空白对照的过氧化值变化较明显，在24 h时即超过压榨核桃油国标限值6 mmol/kg。添加抗氧化剂的核桃油过氧化值上升趋势有所减缓，其中添加0.02% TBHQ的核桃油在60℃恒温加热96 h才超过6 mmol/kg，添加0.02% BHT、0.02% BHA的核桃油均在48 h达到6 mmol/kg。3种抗氧化剂抗氧化效果强弱依次为TBHQ>BHT>BHA。

TBHQ与维生素E类似，均供氢形成稳定自由基，从而终止自由基链反应。BHA和BHT等酚型抗氧化剂可与油脂氧化产生的过氧化物结合，中断自动氧化反应链，阻止氧化[6]。

2.1.2 复合抗氧化剂试验(见图2)

图2 复合抗氧化剂对核桃油过氧化值的影响

对食用油而言，单一的抗氧化剂可能难以达到最佳抗氧化效果，复合使用抗氧化剂可提高食用油氧化稳定性。由图2可知，在复合抗氧化剂总量不超过0.02%条件下，核桃油过氧化值随着加热时间的延长均逐渐升高。空白对照的过氧化值在24 h时已超过6 mmol/kg，变化显著。添加不同复合抗氧化剂的过氧化值显著低于空白对照的，其中添加0.01%TBHQ+0.01%BHT的核桃油超过192 h过氧化值才高于6 mmol/kg。与图1相比，复合抗氧化剂的效果优于单一抗氧化剂，这是因为各种抗氧化剂在发挥协同抗氧化作用时，产生的游离基也会生成新的酚类化合物，继续发挥抗氧化作用，从而增强其抗氧化性[7-8]。

通过单一和复合抗氧化剂的抗氧化加速试验，选择复合抗氧化剂0.01%TBHQ+0.01%BHT作为最优抗氧化剂，与增效剂进行复配试验。

2.2 最优抗氧化剂与增效剂复配(见图3、图4)

图3 复合抗氧化剂与柠檬酸复配对核桃油 过氧化值的影响

图4 复合抗氧化剂与抗坏血酸复配对核桃油 过氧化值的影响

常用的增效剂有柠檬酸、抗坏血酸、异抗坏血酸、植酸、磷酸、乙二胺四乙酸(EDTA)等。由图3和图4可知，随着加热时间的延长，添加不同量柠檬酸、抗坏血酸的核桃油过氧化值均逐渐升高。空白对照的过氧化值在192 h时超过6 mmol/kg，而添加柠檬酸、抗坏血酸的核桃油过氧化值达到6 mmol/kg的加热时间有不同程度的延长。其中添加0.010%柠檬酸的核桃油在312 h超过6 mmol/kg，添加0.010%和0.012%抗坏血酸的核桃油过氧化值差异不明显，超过288 h达到6 mmol/kg。

核桃油中的Cu2+、Fe2+、Mn2+、Ni2+等金属离子能催化油脂氧化，缩短氧化诱导期，提高过氧化物的分解速度和自由基的产生速度，并使抗氧化剂迅速发生氧化而失去作用。而加入的柠檬酸、 抗坏血酸等络合了这些金属离子，使抗氧化剂抗氧化活性再生，从而发挥其抗氧化增效作用，延长油脂的储藏期[8]。

2.3 响应面优化试验

2.3.1 响应面试验回归模型及优化

根据单因素试验结果，以复合抗氧化剂(TBHQ与BHT质量比1∶1)、柠檬酸、抗坏血酸加量为自变量，以过氧化值(Y)为响应值，采用三因素三水平进行Box-Behnken试验设计，建立用于分析和预测核桃油抗氧化剂的数学模型。响应面试验因素水平见表1， 响应面试验设计方案与结果见表2。

表1 响应面试验因素水平

表2 响应面试验设计方案与结果

注：核桃油在60℃烘箱加热120 h后测定的过氧化值。

应用Design-Expert 8.0.7软件对表2试验结果进行多元回归拟合分析，可得到过氧化值(Y)与各因素之间的二次多项模型：Y=4.14-0.64A-0.32B-0.13C+0.27A2+0.023B2-0.056C2+5.882E-003AB-0.049AC-0.12BC。对回归模型进行方差分析，结果见表3。

表3 回归模型方差分析

由表3可知，对产品过氧化值(Y)的影响大小依次为A>B>A2>C>BC>C2>AC>B2>AB，其中A、B、C、A2和BC影响极显著(P<0.01)，AC和C2影响显著(P<0.05)，而AB、B2影响不显著(P>0.05)。该回归模型P小于0.000 1，表明该方程模型极显著；模型失拟项不显著(P=0.138 3>0.05)，即该方程拟合较好；模型相关系数R2为0.998 0，大于0.9，说明模型高度相关；信噪比RSN为68.624，大于4，说明模型设计合理，可用于预测。

2.3.2 最适条件及验证试验

对Design-Expert分析得到的优化回归方程求解极小值，结果表明，当复合抗氧化剂、柠檬酸、抗坏血酸加量分别为0.017%、0.012%、0.010%时，核桃油在60℃烘箱加热120 h的过氧化值为3.40 mmol/kg。为验证方案的有效性，在此条件下进行3次重复验证试验，平均过氧化值为3.45 mmol/kg，实际值与预测值基本相近，在模型误差允许范围内，采用响应面Box-Behnken优化获得的核桃油抗氧化剂保鲜方案准确可靠，对工业化生产具有实际的指导意义。

2.4 核桃油货架期的预测

对添加最优复合抗氧化剂和增效剂的核桃油进行60℃烘箱储存试验，结果见图5。

由图5可知，随加热时间延长，空白样品的过氧化值迅速增加，而添加最优组合的抗氧化剂和增效剂的核桃油储藏期由24～48 h延长到432 h。根据阿仑尼乌斯(Arrhenius)公式得出的油脂储存温度与其货架期之间的关系，Schaal烘箱法试验60℃条件下储存1 d相当于20℃条件下贮藏16 d[9-10]。因此，该核桃油在20℃条件下的理论货架期为288 d。

图5 最优复合抗氧化剂和增效剂对核桃油过氧化值的影响

3 结 论

添加抗氧化剂可显著增强核桃油的稳定性，复合抗氧化剂抗氧化效果明显优于单一抗氧化剂，复合抗氧化剂0.01%TBHQ+0.01%BHT的抗氧化效果最好；柠檬酸和抗坏血酸对抗氧化剂均有增效作用，柠檬酸的作用更强；0.017%复合抗氧化剂(TBHQ与BHT质量比1∶1)、0.012%柠檬酸和0.010%抗坏血酸的组合抗氧化效果最好，核桃油在20℃下的理论货架期为288 d。