大卫颗粒的质量标准提高△

李晓，王学方，张丽先，李飞飞，宁二娟，魏悦

1.河南省生物技术开发中心，河南 郑州 450002；2.河南省植物天然产物开发工程技术研究中心，河南 郑州 450002

大卫颗粒由连翘、黄芩、柴胡、金银花、甘草、紫苏叶6味中药组成，收载于《中药部颁标准》(第十册)，具有清热解毒、疏风透表之功效[1]。临床主要用于感冒发烧、头痛、咳嗽、鼻塞流涕、咽喉肿痛等症，研究表明，大卫颗粒治疗小儿病毒性上呼吸道感染总有效率达92.4%，明显优于利巴韦林对照组(79.1%)[2]；此外，大卫颗粒对妊娠期急性上呼吸道感染的临床症状有明显缓解、可增强机体免疫力，总有效率为92.31%[3]。

但该制剂现行标准较为落后，只收载了薄层鉴别法鉴别绿原酸和相关检查项目，前期有文献报道了大卫颗粒中绿原酸、黄芩苷等成分的含量测定方法[4-5]，但是其全面的质量标准研究未见报道。大卫颗粒已上市多年，临床应用量大[6]，尤其是在儿科[7]，故有必要加强其质控方法和标准研究，保证其临床疗效与安全性。

为此，本研究对制剂中主要药味连翘、金银花、柴胡等进行薄层色谱(TLC)鉴别，并对其中绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷的含量进行高效液相色谱(HPLC)测定，为其质量标准提高提供参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津，CMA-20A系统、LC-20AT二元高压泵、SIL-20A自动进样器、CTO-20A柱温箱、SPD-M20A检测器、LC Soulation工作站)；GoodSee-20E薄层色谱成像系统(上海科哲生化科技有限公司)；ME204型万分之一分析天平[托利多仪器(上海)有限公司]；AUW220D十万分之一分析天平(日本岛津)。

1.2 试药

大卫颗粒(陕西兴邦药业有限公司，批号分别为：160902、161001、161101，规格：6 g/袋)；绿原酸对照品(批号：110753-201415，纯度96.2%)、黄芩苷对照品(批号：110715-201619，纯度93.5%)、连翘酯苷A对照品(批号：111810-201606，纯度93.4%)、连翘苷对照品(批号：110821-201615，纯度94.9%)、甘草苷对照品(批号：111610-201607，纯度93.1%)、金银花对照药材(批号：121060-201608)、连翘对照药材(批号：120908-201216)、柴胡对照药材(批号：120992-201509)均购自中国食品药品检定研究院；硅胶G薄层板、硅胶H薄层板(青岛海洋化工厂)；乙腈为色谱纯；水为屈臣氏纯净水；正丁醇、甲醇、三氯甲烷等其他试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 连翘 供试品溶液：取本品4 g，加60 mL水溶解，用40 mL水饱和的正丁醇振摇提取，重复操作3次，将正丁醇液合并，分取60 mL供柴胡鉴别用，剩余的正丁醇液减压回收至干，残渣加2 mL甲醇溶解，即得[8]。

对照药材溶液：取连翘对照药材0.5 g，加40 mL水，加热微沸1 h，滤过，滤液按供试品溶液制备方法制备，即得。

对照品溶液：取连翘苷对照品10 mg，加甲醇制成0.5 mg·mL-1的溶液，即得。

阴性对照溶液：按大卫颗粒处方取缺连翘的其他药味，按其制剂工艺制备缺连翘的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制备，即得。吸取上述4种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，展开剂为三氯甲烷-甲醇按体积比5∶1配置，将薄层板展开，取出，晾干，采用10%硫酸乙醇溶液为显色剂，在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果阴性对照对检测无干扰，供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，见图1。

注：1～3.供试品；D.对照药材；S.对照品；Y.阴性对照。图1 连翘的薄层色谱图

2.1.2 金银花 供试品溶液：取2 g本品，加15 mL甲醇，超声处理20 min，用甲醇补足减失的溶剂量，滤过，取续滤液，即得。

对照药材溶液：取0.5 g金银花对照药材，加15 mL甲醇，按供试品溶液制备方法制成，即得。

对照品溶液：取绿原酸对照品10 mg，加甲醇制成质量浓度为1 mg·mL-1的溶液，即得。

阴性对照溶液：按大卫颗粒处方取缺金银花的其他药味，按其制剂工艺制备缺金银花的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制备，即得。

吸取上述4种溶液各6 μL，分别点于同一硅胶H薄层板上，以乙酸丁酯-甲酸-水按体积比7∶2.5∶2.5配置，静置，取上层溶液为展开剂，将薄层板展开，取出，晾干，置365 nm紫外光灯下检视[9]。结果阴性对照对检测无干扰，供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，均显蓝色荧光斑点，见图2。

注：1～3.供试品；D.对照药材；S.对照品；Y.阴性对照。图2 金银花的薄层色谱图

2.1.3 柴胡 供试品溶液：取2.1.1中剩余的正丁醇液，加入等体积的氨试液洗涤，再用等体积正丁醇饱和的水洗涤，弃去水层，正丁醇液减压回收至干，残渣加1 mL甲醇溶解，即得。

对照药材溶液：取柴胡对照药材0.5 g，加40 mL水，加热微沸1 h，滤过，滤液按供试品溶液制备方法制备，即得。

阴性对照溶液：按大卫颗粒处方取缺柴胡的其他药味，按其制剂工艺制备缺柴胡的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制备，即得。吸取上述3种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，展开剂为三氯甲烷-甲醇-水按体积比13∶7∶2配置后，在10 ℃以下放置的下层溶液，将薄层板展开，取出，晾干，采用1%对二甲氨基苯甲醛的硫酸乙醇溶液(1→10)为显色剂，在70 ℃加热至斑点显色清晰后30 min，置紫外光灯(365 nm)下检视[10]，结果阴性对照对检测无干扰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，见图3。

2.1.4 甘草 对照品溶液：取甘草苷对照品10 mg，加甲醇制成质量浓度为0.5 mg·mL-1的溶液，即得。

阴性对照溶液：按大卫颗粒处方取缺甘草的其他药味，按其制剂工艺制备缺甘草的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制备，即得。

吸取2.1.1项下的供试品溶液及上述两种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，展开剂以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水按体积比15∶1∶1∶2配置，将薄层板展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视[11]。结果阴性对照对检测无干扰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，见图4。

注：1～3.供试品；D.对照药材；Y.阴性对照。图3 柴胡的薄层色谱图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适应性 色谱柱Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～15 min，13%A，87%B；15～20 min，13%～15%A，87%～85%B；20～28 min，15%A，85%B；28 min～38 min，15%～35%A，85%～65%B；3～50 min，35%A，65%B)[12]；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为320 nm；柱温35 ℃；进样量为10 μL。在上述色谱条件下，待测成分分离良好，分离度>1.5。

2.2.2 对照品溶液制备 取绿原酸13.70 mg、连翘酯苷A 14.80 mg、黄芩苷17.04 mg，精密称量，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇适量使溶解，再加50%甲醇至刻度，摇匀，即得(临用新制)。

2.2.3 制备供试品溶液 取本品适量，研细，取约0.2 g，精密称定，置100 mL容量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理20 min，放冷，再加50%甲醇至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 专属性试验 按大卫颗粒处方取缺金银花、连翘、黄芩的其他药味，按其制剂工艺制备阴性样品，并按2.2.3供试品溶液制备方法制备，制成阴性对照溶液。分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各适量，按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，见图5。结果，供试品中绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷对照品在相同保留时间处有相同色谱峰，并与其他组分峰基线分离较好，且相应的阴性对照不出峰。表明该方法可以用于该制剂中3种成分的测定。

注：A.对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.绿原酸；2.连翘酯苷A；3.黄芩苷。图5 大卫颗粒的高效液相色谱图

2.2.5 线性关系考察 分别精密吸取2.2.2项下对照品溶液0.2、0.4、0.8、1.0、1.5、2.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇定容制成系列对照品溶液。在2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标，以待测成分浓度(X)为横坐标进行线性回归，绘制标准曲线，得绿原酸回归方程：Y=31 859.2X-30 585，r=0.999 8；连翘酯苷A回归方程：Y=777 875X-3316，r=0.999 9；黄芩苷回归方程：Y=36 127.9X+839.84，r=0.999 9；结果表明，绿原酸在5.228～52.28 μg·mL-1，连翘酯苷A在5.92～59.20 μg·mL-1，黄芩苷在6.816～68.16 μg·mL-1与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.6 进样精密度 取2.2.3项下供试品溶液(批号：160901)，按2.2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积并计算绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷含量。结果3种成分的平均质量分数分别为2.9、5.0、7.2 mg·g-1，峰面积RSD分别为1.10%、0.76%、1.28%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 重复性试验 精密称取同一批样品(批号：160901)适量，共6份，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，再按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷含量。结果3种成分的平均质量分数分别为2.9、4.9、7.2 mg·g-1，峰面积RSD分别为1.62%、1.83%、1.38%，表明本方法重复性良好。

2.2.8 稳定性试验 取2.2.3项下供试品溶液(批号：160901)，分别于制备后 0、2、4、8、12、24 h进样测定，记录峰面积并计算绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷含量。结果3种成分的平均质量分数分别为2.8、4.9、7.2 mg·g-1，峰面积RSD分别为0.96%、1.25%、0.84%，表明供试品溶液室温放置24 h稳定。

2.2.9 加样回收率试验 精密称取同一批样品(批号：160901)适量，共6份，分别加入实际质量浓度为105.84 μg·mL-1绿原酸对照品溶液2 mL，276.46 μg·mL-1连翘酯苷A对照品溶液2 mL，254.37 μg·mL-1黄芩苷对照品溶液3 mL，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，再按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表1。

2.2.10 含量测定 取3批本品各适量，分别按2.2.3项下方法制备供试品溶液，再按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷含量，结果见表2。

表1 加样回收率试验结果(n=6)

表2 样品含量测定结果(n=3) mg·g-1

3 讨论

在TCL鉴别中，原标准中仅收载了绿原酸的薄层鉴别方法，本研究在此基础上，对处方中6味药材的TCL鉴别方法均进行了研究，其中黄芩薄层鉴别中，采用对照药材作对照，阴性样品有干扰，采用黄芩苷对照品作为对照无干扰，但考虑到含量测定中对制剂中黄芩苷的含量进行测定，故本研究未收载黄芩的薄层鉴别，另外紫苏叶的薄层鉴别中阴性样品对鉴别有干扰，未能建立较好的TCL鉴别方法。综上，通过研究最终建立了大卫颗粒中连翘、金银花、柴胡、甘草的TLC鉴别方法。同时，为了考察TLC系统的耐用性，实验中对不同温度(4、25、35 ℃)、不同厂家薄层板进行实验。结果表明，TLC图斑点清晰，分离度好，阴性对照均无干扰。

根据中药质量标准的研究要求，复方中药含量测定方法中，应首选君臣药、贵重药、毒性药，不建议选取含量较低成分。连翘、金银花为大卫颗粒的君药，绿原酸为金银花中的主要功效成分，可作为大卫颗粒的质量控制性成分，连翘中的主要成分有连翘苷、连翘酯苷等，现有大部分连翘制剂多测定其连翘苷含量，但大量研究表明，连翘酯苷是连翘发挥抗菌、抗病毒等作用的主要功能成分[13]，且连翘中连翘酯苷的含量远高于连翘苷[14-15]，所以本研究将连翘酯苷A也作为大卫颗粒的质量控制性成分之一。另外，黄芩药材中指标性成分黄芩苷含量较高(≥9.0%)，且黄芩苷常作为黄芩相关制剂的含量测定成分[16]。综上，本研究选择绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷作为大卫颗粒的质量控制性成分，并采用高效液相法对3种成分同时进行含量测定。

含量测定方法耐用性研究中，我们考察了不同厂家、不同品牌的3种色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Phenomenex Luna 5u C18(2)(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)对制剂中绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷成分的分离情况，3种色谱柱对测定成分的分离均较好；另外实验中还考察了流动相的不同酸度(甲醇-0.1%、0.2%、0.3%磷酸水、乙腈-0.2%、0.5%、0.8%醋酸水溶液)、不同柱温(30、35、40 ℃)对分离效果的影响，结果表明，流动相pH值与柱温在一定的范围内波动，对成分的测定无影响，说明该方法耐用性良好。

综上，本研究所建立的标准可用于大卫颗粒的质量控制，为其质量标准提高提供参考。