HPLC同时测定五味子中7个木脂素类化合物的含量△

王书云，梁宏刚，黄健，王金辉*，杨宝峰

1.河南大学 药学院，河南 开封 475004；2.哈尔滨医科大学药化教研室/省部共建生物医药工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150081；3.沈阳药科大学 中药学院，辽宁 沈阳 110016

五味子为木兰科植物五味子SchisandrachinensisBaill.的干燥成熟果实，主产于辽宁、吉林、黑龙江、内蒙古等地，故又称北五味子。《神农本草经》列为上品，性温，味酸、甘，归肺、肾、心经，具有生津敛汗、益气滋肾、宁心安神的作用，常用于久嗽虚喘、遗尿尿频、心悸失眠等症[1]。

五味子含有多种成分，主要成分为木脂素类，约占8%[2]。五味子中木脂素类化合物以联苯环辛烯型木脂素类化合物为主，且为五味子中最主要的活性成分，如：五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙、戈米辛J、戈米辛K、当归酰戈米辛H等[2-9]。

五味子为临床常用中药之一，具有保肝、镇静、催眠、保护脑神经细胞、提高记忆力、抗老年痴呆、提高免疫力、抗氧化、抗肿瘤等作用[10-18]，其质量优劣直接影响到临床疗效和用药安全。影响药材质量的因素很多，从产地、采收与加工，到五味子的炮制、运输与贮存等方面，均对五味子药材质量优劣产生影响。在前期对五味子指纹图谱研究的基础上，确定五味子中7个主要的化合物，并对这7个主要化合物进行提取、分离、鉴定，确定化合物为：五味子醇甲(1)、戈米辛D(2)、五味子醇乙(3)、当归酰戈米辛H(4)、五味子甲素(5)、戈米辛N(6)、五味子乙素(7)，化合物结构见图1。本文建立同时测定五味子中7个主要的联苯环辛烯型木脂素类化合物含量的HPLC方法，为五味子的质量控制及保证五味子临床用药的安全、有效、质量可控提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Waters高效液相色谱仪(HPLC Waters 2690 Separations Module)，检测器：Waters 2996 photodiode Array Detector，色谱柱：SunFireTMC18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；KQ 5200超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；FA1004N电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；粉碎机(型号：FW-80，功率：460 W，转速：24 000转/min)；SPE固相萃取小柱(ODS，0.5 g)等。

1.2 试药

液相分析用甲醇、乙腈为色谱纯(J.T.Baker)；甲醇、乙醇、95%乙醇等分析纯有机试剂(天津市富宇精细化工有限公司)；磷酸为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)；实验用水均为双蒸水。

对照品五味子醇乙(成都生物制品检定所，批号：MUST-13042601)；五味子醇甲、五味子乙素、五味子甲素(中国食品药品检定研究院，批号分别为110857-201211、110765-200710、0764-200107)；戈米辛D、戈米辛N、当归酰戈米辛H为实验室自制，纯度均大于98%。

五味子药材分别购于沈阳、丹东、吉林、黑龙江等地药材市场或药店。

2 方法

2.1 色谱条件

SunFireTMC18色谱柱 (150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相A(乙腈)-B(水)，梯度洗脱：0～10 min，38%～44%A；10～18 min，44%～45%A；18～28 min，45%～48%A；28～35 min：48%～60%A；35～37 min，60%～47%A；37～65 min，47%～48%A；65～67 min，48%～60%A；67～76 min，60%～61%A；76～78 min，61%～85%A，检测波长：254 nm，柱温：30 ℃，进样量20 μL，理论塔板数以五味子醇甲计算，不低于5000。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、戈米辛D、戈米辛N、当归酰戈米辛H适量，色谱甲醇溶解，配制成质量浓度分别为1.00、1.20、0.94、1.18、1.46、1.13、2.10 mg·mL-1的对照品储备液。

分别精密吸取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、戈米辛D、戈米辛N、当归酰戈米辛H适量至5 mL容量瓶，色谱甲醇定容至刻度，摇匀，即得五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、戈米辛D、戈米辛N、当归酰戈米辛H质量浓度分别为45.00、9.96、7.98、14.99、9.05、10.96、10.92 μg·mL-1的混合对照品溶液。

图1 化合物的结构式

2.3 供试品溶液的制备

精密称取五味子药材粉末约1.0 g，精密加入甲醇25 mL，称质量，超声30 min，冷却，称质量，补质量，精密取上清液2 mL过SPE柱，色谱甲醇洗3次，每次2 mL，将滤液转移至10 mL量瓶，色谱甲醇定容至刻度，摇匀，过0.22 μm滤膜，即得药材供试品溶液。

3 结果

3.1 方法专属性

分别精密吸取空白溶剂、混合对照品溶液、药材供试品溶液20 μL注入高效液相色谱仪测定，按2.1项下色谱条件进行分析，绘制高效液相色谱图，见图2。由色谱图可知，在对照品色谱峰相应的位置上，供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰，且其他杂质对五味子多组分含量测定均无干扰，说明此方法专属性良好。

注：A.对照品；B.样品；1.五味子醇甲；2.戈米辛D；3.五味子醇乙；4.当归酰戈米辛H；5.五味子甲素；6.戈米辛N；7.五味子乙素。图2 对照品和供试品的HPLC图

3.2 线性关系考察

取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、戈米辛D、戈米辛N、当归酰戈米辛H质量浓度分别为45.00、9.96、7.98、14.99、9.05、10.96、10.92 μg·mL-1的混合对照品溶液过0.22 μm滤膜，分别精密进样2、5、10、20、30、40、50 μL，按2.1项下色谱条件进行分析。以对照品进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，得各化合物的回归方程，见表1。

3.3 精密度试验

取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、戈米辛D、戈米辛N、当归酰戈米辛H质量浓度分别为45.00、9.96、7.98、14.9、9.05、10.96、10.92 μg·mL-1的混合对照品溶液在2.1项下色谱条件连续进样6针，进样量20 μL，7个成分的RSD分别为0.93%、0.88%、0.31%、0.91%、1.86%、0.72%、1.41%(n=6)，说明仪器精密度良好，符合含量测定的要求。

3.4 重复性试验

分别精密取五味子药材粉末6份，每份约1.0 g，按2.3项下方法操作制备供试品溶液，分别进样20 μL，在2.1项下色谱条件分析测定，7个成分的RSD分别为1.65%、1.54%、1.55%、1.80%、1.26%、1.94%、1.57%(n=6)，符合含量测定的要求。

3.5 稳定性试验

按2.3项下方法制备的供试品溶液，在0、4、8、12、24、48 h，分别进样20 μL，在2.1项下色谱条件分析测定，结果表明7个化合物在48 h内稳定，RSD分别为0.52%、1.58%、0.63%、1.51%、1.71%、1.41%、1.85%(n=6)符合含量测定的要求。

表1 五味子中7个主要木脂素含量测定的线性、检测限及定量限

3.6 回收率试验

精密称取已知含量的五味子药材粉末6份，每份约0.5 g，分别加入一定量的对照品，按2.3项下方法操作制备供试品溶液，分别进样20 μL，在2.1项下色谱条件分析测定，结果见表2。

表2 五味子中7个木脂素含量测定的加样回收率试验结果(n=6)

3.7 样品测定

分别精密称取不同产地五味子药材粉末约1.0 g，按2.3项下方法操作制备供试品溶液，分别进样20 μL，在2.1项下色谱条件分析测定不同产地五味子中7个化合物的含量，结果见表3。

表3 不同产地五味子中7个木脂素的含量测定结果 mg·g-1

4 讨论

4.1 色谱柱的选择

本文考察了SunFireTM(150 mm×4.6 mm，5 μm)，Shimadzu vp-ODS(150 mm×4.6 mm，5 μm)，Kromasil(150 mm×4.6 mm，5 μm)3种色谱柱对五味子甲醇提取物的分离情况，综合峰形、分离度、使用范围等因素，选定SunFireTM色谱柱作为分析柱。

4.2 色谱条件的选择

为了提高分析的灵敏度和精确度，本文考察了不同流动相组成(甲醇-水，乙腈-水溶液)对实验结果的影响，结果表明，流动相采用水(A)-乙腈(B)梯度洗脱，能够获得良好的色谱分离效果。采用二极管阵列检测器(190～800 nm)对检测波长进行了考察，结果显示，联苯环辛烯型木脂素类化合物在254 nm处均有较好的紫外吸收，且色谱峰信息最为丰富，杂质较少，因此，选择254 nm作为检测波长。

4.3 供试品溶液制备的优化

为了使五味子中联苯环辛烯型木脂素类化合物能被更完全地提取出来，本文首先对提取方式(超声提取、回流提取、索氏提取)、提取溶剂(甲醇、30%甲醇水、50%甲醇水、70%甲醇水、90%甲醇水)、料液比(10、20、25、50倍量)、提取时间(15、30、60、90 min)等影响因素进行考察，记录色谱图。结果显示，以25倍量甲醇为提取溶剂、超声提取30 min制备样品的色谱图峰面积相对较大，化合物总含量相对较高，故最终确定供试品的制备方法：25倍量甲醇超声提取30 min。

本文建立了同时定量测定五味子中7个主要木脂素类化合物的HPLC方法，并测定了收集到的不同产地的15批五味子样品中7个主要木脂素类化合物的含量，结果发现，不同产地五味子中化合物的含量差别不大，7个木脂素的总质量分数最高为16.27 mg·g-1，最低为9.52 mg·g-1。该方法准确、可靠、重复性好，可用于五味子的质量评价。