简化样品处理快速测定酸枣仁中多种成分含量的研究△

周赛男，郭宝林

1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；2.山西医科大学，山西 太原 030001

酸枣仁为鼠李科植物酸枣ZiziphusjujubaMill.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chou的干燥种子，别名枣仁，是我国传统中药，具有养心补肝，宁心安神等功效，也是药食同源物质，主要用于改善睡眠。酸枣仁主要含有皂苷类和黄酮类化学成分，2015版《中华人民共和国药典》[1]规定酸枣仁含量测定成分为皂苷类的酸枣仁皂苷A(jujuboside A)和黄酮类的斯皮诺素(spinosin)，在供试品溶液制备过程中，需要先用石油醚索氏提取4 h去掉油脂，然后加热回流提取2 h，该方法也被大多数含量测定文献采纳[2-10]，但该方法较为繁琐，耗时较长。

含有油脂的种子类药材的成分分析，先脱脂后提取是传统方法，传统认为脂肪含量高时，可能影响目标成分的完全提取，且如果不脱脂，提取液中含有的脂肪可能会影响液相色谱柱的柱效。但经查阅2015版《中华人民共和国药典》中富含油脂类种子药材共有47种，仅有13种采用了先脱脂后提取的工艺，表明该方法不是普遍方法，更值得关注的是，同样测苦杏仁苷含量的桃仁和杏仁两个药材，样品前处理桃仁是先石油醚加热回流1 h脱脂，后70%甲醇加热回流1 h提取，而苦杏仁则直接用甲醇超声处理30 min，说明脱脂过程可能是非必须的。本研究组一直从事酸枣仁的种质资源评价和品种优选工作，为满足大量的样品快速测定，建立了一种不脱脂的样品前处理方法，测定其中的皂苷和黄酮两类成分含量。

1 实验样品、试剂及仪器

1.1 实验样品

酸枣仁样品购自河北安国，产地为甘肃，经中国医学科学院药用植物研究所郭宝林研究员鉴定为鼠李科植物酸枣ZiziphusjujubaMill.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chou的干燥种子。

1.2 药品及试剂

对照品斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B均购自成都曼思特生物科技有限公司，纯度均大于98%。

乙腈(色谱纯)购于美国Fisher公司；蒸馏水购于杭州娃哈哈集团有限公司；其他溶剂均为分析纯。

1.3 主要仪器

ACQUITY UPLC(包括四元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、ELS检测器、TUV检测器、Empower色谱工作站)(美国Waters公司)，AT261DeltaRange+w十万分之一天平(METTLER TOLEDO仪器有限公司)，FA210N电子天平(上饶市鸿翔实业有限公司)。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

分别精密称取4种对照品适量于5 mL容量瓶中，甲醇溶解，定容至刻度，得斯皮诺素2.110 mg·mL-1、6‴-阿魏酰斯皮诺素1.950 mg·mL-1、酸枣仁皂苷A 2.176 mg·mL-1、酸枣仁皂苷B 1.004 mg·mL-1的对照品储备液，并各取1 mL置5 mL的容量瓶中，定容，即得混合对照品储备液。

2.2 色谱条件

色谱柱：ACQUITY C18柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)，流动相为乙腈(A)-水(0.1%甲酸)，梯度洗脱(0～4 min，14.5%～16%A；4～5 min，16%～20% A；5～9 min，20% A；9～11 min，20%～37% A；11～17 min，37% A；17～19 min，37%～100% A；19～22 min，100% A；22～24 min，100%～14.5% A；24～27 min，14.5% A)；体积流量0.3 mL·min-1；柱温35 ℃；进样量3 μL；TUV检测波长：335 nm；ELSD条件漂移管温度60 ℃，气压25 psi。色谱图如下图1。

注：1.斯皮诺素；2.6‴-阿魏酰斯皮诺素；3.酸枣仁皂苷A；4.酸枣仁皂苷B；A.对照品UV色谱图；B：样品UV色谱图；C：对照品ELSD色谱图；D：样品ELSD色谱图。图1 酸枣仁4种成分的UPLC色谱图

2.3 酸枣仁样品前处理快速方法的建立

2.3.1 几种提取方法和《中华人民共和国药典》样品处理方法的比较 《中华人民共和国药典》方法(以下简称药典方法)：取本品粉末约1 g，精密称定，置索氏提取器中，加石油醚(60～90 ℃)适量，加热回流4 h，弃去石油醚液，药渣挥去溶剂，转移至锥形瓶中，加入70%乙醇30 mL，加热回流2 h，滤过，滤渣用70%乙醇5 mL洗涤，合并洗液和滤液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得[1]。

直接回流法：取本品粉末约1 g，精密称定，转移至圆底烧瓶中，加入70%乙醇30 mL，加热回流(时间又分为10、20、30、40、60和120 min)，滤过，滤渣用70%乙醇5 mL洗涤，合并洗液和滤液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

超声提取法：取本品粉末约1 g，精密称定，转移至锥形瓶中，加入70%乙醇30 mL，常温超声(超声时间又分为30、60和90 min)，滤过，滤渣用70%乙醇5 mL洗涤，合并洗液和滤液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

共10种不同的处理方法，各3个重复，斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B 4种成分的峰面积结果见图2。

从图2各个处理4个成分的峰面积及显著性差异分析结果可以看出，几种加热回流方法中，黄酮类的斯皮诺素和6‴-阿魏酰斯皮诺素加热回流10～30 min峰面积呈上升趋势，30～120 min呈下降趋势，加热回流30 min组高于与其他各回流组，且均有显著性差异(6‴-阿魏酰斯皮诺素的30 min组和40 min组无显著差异)；皂苷类成分酸枣仁皂苷A加热回流10～40 min呈上升趋势，40～120 min略有下降，回流40 min组高于其他组，与10～30 min各组有显著差异，而与60、120 min组无显著性差异；酸枣仁皂苷B加热回流10～60 min峰面积呈上升趋势，回流120 min时峰面积略有下降，回流60 min组高于其他组，且均有显著差异。因此两类成分均表现为加热回流时间过长有含量降低的趋势(可能发生了降解)，但是黄酮类成分降低幅度较大，综合考虑两类成分，加热回流30 min为最佳的回流方法。

图2 10种前处理方法结果(n=3)

几种超声方法中，斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素和酸枣仁皂苷A均表现超声30～90 min峰面积呈上升趋势，超声90 min的峰面积最高，且均与30 min有显著差异，斯皮诺素则与超声60 min也有显著差异。酸枣仁皂苷B则60 min的峰面积最高，与超声30 min有显著差异，但是与超声90 min没有显著差异，综合考虑两种成分，超声90 min为最佳超声方法。

药典方法的结果，除了酸枣仁皂苷B外，均显著低于回流30 min的提取方法，也显著低于回流时间120 min的提取方法，说明药典方法中较长的回流时间会导致成分降解，特别是黄酮类，是不合适的，且脱脂的过程也使得一些成分丢失。超声90 min的方法在皂苷类成分提取效果上和回流30 min无显著差异，但黄酮类成分略低于回流的提取率，斯皮诺素低2.6%，6‴-阿魏酰斯皮诺素低4.0%。但因超声方法便利，且对于热敏感的黄酮类成分更容易控制，因此本文推荐用超声90 min的处理方法。

在超声提取法中，又考察了提取溶剂(甲醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇)、提取物料比(1∶10，1∶20，1∶30，1∶40)对待测成分提取率的影响。最终优化的提取条件为70%乙醇作为提取溶剂，物料比1∶30。

2.4 超声提取法的方法学考察

2.4.1 线性关系 精密吸取混合对照品储备液2.5 mL置5 mL的容量瓶中，定容，逐级稀释，即得各系列的混合标准品溶液。按照2.3项下条件进样3 μL，其中斯皮诺素和6‴-阿魏酰斯皮诺素以UV检测峰面积(Y)对对照品浓度(X，mg·L-1)进行线性回归，酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B以ELSD检测峰面积的对数(Y)和对照品浓度的对数(X)进行线性回归，得各对照品回归方程、相关系数及线性范围(表1)。

表1 酸枣仁中4个化合物的线性方程、相关系数和线性范围

2.4.2 精密度试验 精密吸取对照品溶液按2.3项下色谱条件，于1 d内连续进样，记录峰面积。结果显示，对照品斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B日内峰面积RSD分别为1.73%、1.89%、2.74%、2.94%；连续3 d内每天连续进样6次，测得日间峰面积RSD分别为2.54%、2.78%、3.15%、3.03%。

2.4.3 重复性试验 取样品粉末6份，分别按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.3项下色谱方法测定，计算斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B的RSD分别为2.35%、2.05%、2.75%、3.32%，结果表示实验的重复性良好。

2.4.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定。计算斯皮诺素，6‴-阿魏酰斯皮诺素，酸枣仁皂苷A，酸枣仁皂苷B 含量的RSD分别为2.43%、2.25%、2.83%、3.02%，结果表明供试品在24 h内稳定。

2.5 加样回收率实验

取已知含量的供试品粉末(WS-15)9份，每份各约0.5 g，精密称定，置50 mL的具塞锥形瓶中，精密加入各标准品斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B，按照2.1项下方法平行制备，2.3项下色谱方法测定，测得四种化合物的平均回收率见表2，结果表明该方法的准确性较好。

表2 酸枣仁中4个成分的加样回收率(n=3)

3 讨论

本文为了简化酸枣仁含量测定的方法，在样品前处理过程中考察了简单超声提取法、直接加热回流法和脱脂后加热回流提取法(药典方法)，通过比较斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B等4种成分的峰面积发现，加热回流30 min是最佳方法，但超声90 min的效果与之相差较小，且易于操作，因此推荐超声90 min的方法。经过方法学验证，该方法快速、准确，为控制酸枣仁中黄酮类成分和皂苷类成含量的快速测定提供了可靠的方法。

本文的比较研究结果表明药典方法测定的两类成分偏低，使用本文提供的超声方法，斯皮诺素、6‴-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B等4种成分测得含量值分别比药典方法高14.4%、10.8%、23.2%、2.2%。