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萝卜硫素通过调节Bax表达降低结肠癌细胞株对5-氟尿嘧啶的耐药性

2019-05-13顾文燕李丽吴敏

中国现代中药 2019年4期
关键词:质粒结肠癌试剂盒

顾文燕,李丽,吴敏

恩施土家族苗族自治州中心医院,湖北 恩施 445000

结肠癌(colon cancer)属于消化道最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率位于所有恶性癌症的第3位[1]。结肠癌的治疗主要依靠手术,然而化疗整个过程易产生药物的耐药性,成为结肠癌患者复发或死亡的主要原因[2]。于是,解决结肠癌多药耐药问题已成为当前研究的热点。研究已证实,中药在辅助治疗肿瘤中有着较好的效果,并且其引发的不良反应较少,患者可耐受药物应用[3]。萝卜硫素(sulforaphane,SFN)又称1-异硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷,分子式为:C6H11S2NO,其结构式见图1,是一种来源于十字花科植物的异硫氰酸酯类化合物,已发现SFN在抗乳腺癌、前列腺癌及克隆癌等多种肿瘤细胞方面均表现出较强的生物活性[4-6]。还发现SFN在一定剂量下对白血病细胞增殖具有抑制作用,还能增强化疗药物的敏感性[7]。然而SFN是否影响5-氟尿嘧啶(5-FU)对结肠癌细胞的敏感性还有待研究。5-FU为临床上广泛使用的基础药物,然而95%的结直肠癌患者出现了5-FU的抗性,极大降低了患者的治愈率。肿瘤细胞获得耐药性的机制是很复杂的,如药物靶点发生变化、药物失活、细胞内药物的流入与流出,药物引起的损伤及逃避凋亡等[8]。Bax信号通路对结肠癌在内的多种肿瘤发生发展均表现出调控作用[9]。早期研究发现,人结肠癌细胞SW-480对5-FU能够产生耐药性[10],穿心莲内酯能够通过上调Bax表达逆转人结直肠癌对5-FU的耐药性[11]。因此,本文研究了SFN能否增强5-FU对结肠癌细胞化疗耐受的能力,及其对结肠癌SW-480细胞凋亡的影响。

图1 萝卜硫素结构式

1 材料

1.1 仪器

BBS-DDC超净工作台(山东博科科学仪器有限公司);LRH-150 BOD CO2细胞培养箱(美国Thermo公司);Victor3 1420 Multilable Counter酶标仪(DX540,美国);DYCZ-24DN凝胶电泳仪(北京六一仪器厂);成像系统(BIO-RAD,美国);CytoFLEX LX流式细胞仪、Bio-Rad iQ5实时荧光定量PCR仪(贝克曼,中国)。

1.2 试药

结肠癌SW-480细胞株由武汉巴菲尔公司提供(来自美国ATCC细胞库);萝卜硫素(杭州林格贝科技有限公司,含量≥99%);DMEM高糖培养基、胎牛血清(美国Gibco公司);胰蛋白酶(Thermo Scientific公司);5-氟尿嘧啶(上海吉至公司,CAS66-22-8,0.25 g·(10 mL)-1;CCK8试剂盒(日本同仁公司,批号:WST-78);RIPA裂解液(上海吉诺公司);BCA试剂盒(北京百奥公司);RNA提取试剂盒及superRreal PreMix Plus(SYBR Green)(TIANGEN公司);Annexin V-FITC/PI试剂盒(碧云天公司);β-actin、Bax抗体(英国Abcam公司);HRP标记羊抗兔IgG(上海谷歌公司);Lipo2000转染试剂盒(上海博耀生物科技有限公司,批号:11668-027)。

2 方法

2.1 SW-480细胞培养

结肠癌SW-480细胞采用DMEM完全培养基培养,包含10%胎牛血清、1%双抗(100 U·mL-1青霉素+100 U·mL-1链霉素),培养箱条件设置:温度37为℃、5%CO2浓度、恒湿。细胞生长融合至80%~90%,采用0.25%胰酶-0.125%EDTA溶液消化,显微镜下观察细胞变圆后立即加入培养基终止消化,并以1∶3比例传代培养。

2.2 CCK8法检测SW-480细胞活力

将对数生长期细胞接种于96孔板进行实验,培养过夜后,加入不同浓度(0、10、20、40 μmol·L-1)的SFN,联合不同剂量的5-FU(0、5、10、20、50、100 μmol·L-1)对SW-480细胞进行干预24 h后,吸干旧培养液,每孔加入10 μLCCK8试剂,将96孔板继续放入培养箱中培养2 h后,用酶标仪测定450 nm处的吸光度值,计算细胞活力。

细胞活力(%)=A药物组/A对照组×100

(1)

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡

将对数生长期细胞接种于6孔板进行实验,分为对照组(Control)、萝卜硫素组(SFN组,20 μmol·L-1)、5-氟尿嘧啶组(5-FU组,5 μmol·L-1)、SFN+5-FU联合组,待药物干预24 h后,将收集的细胞重悬于Binding Buffer中,依次加入Annexin V-FITC 5 μL和PI 5 μL,室温避光孵育,流式细胞仪检测细胞凋亡率;图3中右下限代表早期凋亡细胞数、右上限代表中晚期凋亡细胞数。

2.4 RT-PCR分析Bax、Suvivin、Bcl-2、p53及caspase-3 mRAN表达

将对数生长期细胞接种于6孔板进行实验,药物干预方法及实验分组按照2.3项进行。待药物干预细胞结束后,收集细胞加入TRIzol提取细胞总RNA,并对核酸进行浓度及纯度法测定。吸去1 μg总RNA逆转录cDNA,程序设定为30 ℃(10 min)→42 ℃(50 min)→85 ℃(10 min)→4 ℃(5 min)。根据试剂说明书,RT-PCR体系为20 μL,cDNA 2 μL,引物4 μL,2×FastFire qPCR PreMix 10 μL,dd H2O 4 μL。扩增条件设置为:94 ℃(10 min);94 ℃(15 s);60 ℃(1 min);循环40次。以β-actin作为内参,基因引物序列见表1。mRNA表达水平以2-ΔΔCt计算相对表达量,以β-actin作为内参。

表1 引物序列

2.5 Western Blot实验

将细胞分为4组:对照组、SFN组、5-FU组及SFN+5-FU联合组,带药物处理24 h后,收集药物处理完的细胞,裂解细胞离心制备成匀浆后,采用BCA法测定总蛋白浓度,每孔上样50 μg蛋白进行凝胶电泳,待蛋白分离完成后进行转膜实验。之后采用5%脱脂牛奶对条带进行封闭1 h,然后加入β-actin、Bax抗体(稀释比1∶1000)4 ℃孵育过夜,洗膜后HRP标记羊抗兔IgG,室温孵育1 h后,洗膜3次后,ECL显色曝光,采用Image J软件分析蛋白含量。

2.6 Bax低表达转染实验

低表达质粒pcDNA-Bax siRNA由武汉巴菲尔生物有限公司合成,引物序列为:F 5′-ATGTTGGGGATCCATGAGCTTCCTGAGCCGA-3′;R 5′-GGTTGGCTCGAGTCAGTATATAGTAAGGCT-3′。具体步骤如下:单链目的片段Bax-siRNA与线性质粒载体连接;取5 μL过夜连接产物转化感受态细胞,涂布与含Kanar抗性的LB平板上选择培养;用试剂盒小量提取质粒,用EcoRI做酶切鉴定,挑选酶切鉴定正确的质粒转化菌液Bax-siRNA测序。NC序列为GCCTGCATCATCAAATCCA,Bax-siRNA序列为CAGTCTGAAGCACTTATAA。采用Lipo 2000转染试剂盒进行转染,操作按照说明书进行。将细胞接种于6孔板,待细胞融合至80%左右开始转染;将4 μg质粒DNA加入到250 μL DMEM培养液中混匀,取10 μL Lipo 2000加入到另外250 μL DMEM培养液中混匀,室温下静置5 min;然后将上述两种DMEM培养液混合,总体积500 μL,轻轻混匀后室温下静置20 min,最后将混匀溶液轻轻加入到6孔板中,转染4~6 h后更换为新鲜培养液,转染24 h后检测Bax蛋白表达。

2.7 统计分析

3 结果

3.1 SFN增强5-FU对SW-480细胞株增殖能力的抑制效应

为了探讨SFN是否增强5-FU对结肠癌SW-480细胞增殖能力的抑制效应,采用不同浓度的SFN联合不同剂量的5-FU对SW-480细胞进行干预。见图2。在相同剂量SFN处理前提下,联合5-FU处理,随着5-FU剂量的升高,SW-480细胞增殖能力明显减弱;在相同剂量5-FU干预基础之上,较高SFN的干预浓度可使SW-480细胞增殖活性降低。提示5-FU可抑制SW-480细胞的增殖能力,并表现出剂量依赖性;SFN还可增强5-FU对SW-480细胞增殖的抑制效应。

图2 SFN增强5-FU对SW-480细胞增殖的抑制效应

3.2 SFN增强5-FU对SW-480细胞凋亡的诱导效应

流式细胞仪分析了SFN+5-FU联合对SW-480细胞凋亡的影响,结果见图3~4。表明SFN+5-FU联合组细胞凋亡率(51.10±6.34)%显著高于5-FU组细胞凋亡率(36.76±4.29)%,差异有统计学意义(P<0.05)。还发现5-FU组、SFN+5-FU联合组细胞凋亡率均显著高于对照组(9.21±3.26)%,差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 SFN对5-FU诱导SW-480细胞凋亡的影响

注:与Control组比较,*P<0.05;与5-FU组比较,#P<0.05。图4 SW-480细胞凋亡率比较

3.3 SFN对凋亡基因mRNA表达的影响

SFN、5-FU及其联合干预SW-480细胞后,细胞中凋亡相关的Bax、Suvivin、Bcl-2、p53及caspase-3基因表达结果见图5。提示SFN+5-FU联合组Bax基因表达量显著高于5-FU组,差异有统计学意义(P<0.05),说明SFN能增强5-FU对SW-480细胞中促凋亡基因Bax表达的诱导作用;然而SFN+5-FU联合组与5-FU组中Suvivin、Bcl-2、p53及caspase-3基因表达水平比较差异没有统计学意义(P>0.05)。

注:与5-FU组比较,*P<0.05。图5 SFN对SW-480细胞凋亡基因表达的影响

3.4 SFN对Bax蛋白表达的影响

SFN、5-FU及其联合干预SW-480细胞后,Bax表达水平见图6,提示SFN+5-FU联合组Bax表达量显著高于5-FU组,差异有统计学意义(P<0.05)。说明SFN能增强5-FU对SW-480细胞中促凋亡蛋白Bax表达的诱导作用。

注:与5-FU组比较,*P<0.05。图6 SFN对SW-480细胞Bax蛋白表达的影响

3.5 低表达质粒下调SW-480细胞表达Bax

采用Bax低表达质粒转染结肠癌SW-480细胞,应用Western Blot分析Bax蛋白表达量,结果见图7,提示筛选的pcDNA-Bax质粒可显著降低细胞中Bax蛋白表达。

注:与Control组比较,*P<0.05。图7 pcDNA-Bax质粒下调SW-480细胞中Bax的表达

3.6 Bax低表达减弱SFN对5-FU的敏感性

为了探讨低表达Bax是否影响SFN对5-FU的敏感性,采用pcDNA-Bax质粒转染SW-480细胞,同时应用5 μmol·L-15-FU及20 μmol·L-1SFN对细胞进行孵育24 h后,检测细胞活力,见图8。提示与对照组比较,SFN+5-FU组细胞活力显著降低(P<0.05),而Bax低表达能明显减弱SFN和5-FU联合对SW-480细胞的抑制作用(P<0.05)。

注:与Control组比较,*P<0.05;与SFN+5-FU组比较,#P<0.05。图8 低表达Bax减弱SFN协同5-FU的肿瘤抑制效应

4 讨论

系统性化疗已是结肠癌规范化治疗必不可少的环节,术前、术后均可采用药物进行辅助化疗,提高晚期肿瘤患者获得手术治疗的机会。正是由于采用各种化疗药物对结肠癌患者进行干预,才能够促使晚期结肠癌患者的总生存率得以提升。然而,恶性肿瘤细胞对化疗药物的多药耐药是治疗失败的关键因素,不仅降低了患者的生存质量,还导致大量医疗资源的浪费。肿瘤细胞产生的多药耐药机制非常复杂,研究已证实,P-gp糖蛋白跨膜转运能力的变化、细胞解毒活力的提升、DNA损伤修复系统紊乱及凋亡通路的异常等方面均与多药耐药现象有关[12]。然而无论体外研究还是临床治疗应用中,对上述耐药因素进行干预进行耐药逆转,仍然存在较多问题。

SFN是一种药理活性较强的天然活性物质,在抗肿瘤方面也具有较好的作用效果,并且还提出其具有增强白血病细胞对化疗药物的敏感性[7]。SFN通过对细胞癌变起始期的调控,诱导肿瘤细胞走向凋亡,还能够阻滞肿瘤血管形成及降低肿瘤细胞侵袭转移[13]。研究还发现,SFN可通过诱导促凋亡蛋白Bax表达抑制肝癌细胞增殖、诱导其凋亡及降低其侵袭转移能力[14]。本研究发现,SFN能够增强5-FU对结肠癌SW-480细胞增殖的抑制效应,说明SFN可诱导SW-480细胞对5-FU的敏感性;并且研究还发现,SFN+5-FU联合处理组中SW-480细胞凋亡率比单独5-FU组的凋亡率明显升高,提示SFN能增强5-FU诱导的SW-480细胞凋亡。

通过流式细胞仪发现,SFN能增强5-FU诱导的SW-480细胞凋亡,于是笔者从细胞凋亡角度考察介导SFN逆转化疗耐药可能的分子机制,对可能的凋亡相关基因(Bax、Suvivin、Bcl-2、p53及caspase-3)进行了检测分析。结果证实,SFN+5-FU联合组中Bax mRNA表达显著高于其他3组。于是设想Bax可能介导了SFN逆转结肠癌细胞耐药的过程,但具体机制尚不清楚。Bax基因家族是目前研究较多的与凋亡相关的基因,也是最受关注的促凋亡发生的基因家族[15]。研究已发现,Bax的表达在结肠癌的发生发展中发挥重要的作用,Bax蛋白家族与其他家族成员构成复杂的相互作用网络,共同调控细胞凋亡[16]。除此之外,研究已证实,Bax与肿瘤细胞的耐药发生机制密切相关[17-18]。本文实验结果进一步证实,SFN+5-FU联合处理组SW-480细胞中Bax蛋白表达水平明显高于5-FU单独处理组。为了进一步验证SFN通过调节Bax表达逆转结肠癌细胞对5-FU化疗的耐药作用,采用pcDNA-Bax低表达质粒抑制结肠癌细胞中Bax表达,发现Bax低表达降低了SFN+5-FU联合作用对SW-480细胞活力的抑制作用。总之,SFN可增强5-FU对结肠癌细胞增殖活力的抑制效应,并且还对Bax表达具有较强的诱导作用,提示SFN可通过增加Bax表达诱导结肠癌细胞对5-FU的敏感性。

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