新型TRK激酶小分子抑制剂的筛选与验证

王 田，吴燕华

(1.复旦大学 生命科学学院，上海 200438； 2.上海药明康德新药开发有限公司生物部，上海 200131)

原肌球蛋白相关激酶(Tropomyosin-Related Kinase, TRK)是一类神经生长因子受体.其家族由高度同源性的TRK-A、TRK-B和TRK-C激酶组成，分别由NTRK1、NTRK2和NTRK3基因编码[1].TRK激酶与神经生长因子配体结合后，通过二聚化及自身磷酸化被激活，进而激活下游的信号分子.已有研究显示TRK激酶介导的信号通路与细胞增殖、分化、代谢、凋亡等功能密切相关[2].近几年的研究发现，TRK激酶在多种恶性肿瘤中经过多种机制被激活，主要是结构重排和表达改变.例如，NTRKs与其他的基因重排产生嵌合癌基因，导致TRK激酶在结构上和表达上发生改变，不再受到神经生长因子配体的调节和控制，发生组成型突变，促进肿瘤发生发展[3].

蛋白激酶都拥有一个高度保守的催化核心区域——与ATP结合的催化裂口(catalytic cleft)，常位于N末端区域和C末端区域之间[4].它由多个亚基折叠形成一个铰链结构，ATP的腺嘌呤环通过氢键与铰链区域结合，核糖具有高疏水性，磷酸基则极易变曲变形，是亲水且与溶剂结合的区域[5].当下，TRK激酶小分子抑制剂的设计思路大部分是通过模仿ATP的结构，筛选与ATP竞争结合激酶催化区域位点的小分子化合物，抑制TRK激酶酪氨酸残基的磷酸化，从而阻断下游信号通路的传导，抑制肿瘤细胞的生长、增殖、转移等，发挥抗肿瘤的功效[6-7].

2018年11月，TRK激酶抑制剂LOXO-101获批上市，另一个很有潜力的抑制剂Entrectinib也已经向美国FDA提交上市申请.这两个药物在临床实验中主要用于NTRK基因融合、ALK及ROS1基因突变的肿瘤患者进行干预和治疗，效果显著[8-9].例如，NTRK基因融合(SQSTM1-NTRK1)的非小细胞肺癌患者服用Entrectinib药物26天后，实体瘤缩小了47%，服用155天后，肿瘤大小缩小了77%，并且病人的呼吸功能得到了明显的改善[10].LOXO-101对17种NTRK融合的肿瘤患者有积极的治疗效果，有效率高达76%，其中12%的患者的肿瘤完全消失[11-12].本研究从已知的化合物库中发掘出对TRK激酶有潜在作用的抑制剂，探索“老药新用”的可能性.这些抑制剂的研究相对比较成熟，大多数已进入临床研究阶段，少数已经批准上市.上市药物的药物代谢和安全性资料都较为详尽，如果发现这些药物的新用途，则较快的就可以进入临床评估，大大缩短了开发周期，实现资源的最大化利用.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

TRK-A/B/C激酶、IMDM培养基及胰蛋白酶购自Thermo Fisher公司；小分子化合物库及阳性化合物Entrectinib购自上海蓝木化工有限公司；HTRF激酶检测试剂盒购自Cisbio公司；胎牛血清购自Hyclone公司；CellTiter-Glo试剂盒购自Promega公司.

1.1.2 细胞

人结肠癌KM12细胞，购自日本JCRB细胞库；人肺癌NCI-H1975细胞，购自ATCC细胞库.

1.1.3 仪器

Envision 2104多功能酶标仪购自Perkin Elmer公司；Echo-555液体工作站购自Labcyte公司；Bravo液体工作站购自Agilent公司；Vi-cell细胞计数仪购自Beckman公司；IncuCyte购自Essen公司.

1.2 方法

1.2.1 HTRF(Homogeneous Time Resolved Fluorescence)方法初筛化合物

1.2.2 初筛小分子化合物的IC50值测定

利用Echo仪器将化合物进行3倍梯度稀释，制备得到10000，3333，1111，370，123，41，13.7，4.57，1.52，0.51nmol/L和0.17nmol/L各终浓度.按照初筛方法进行实验，用XLfit软件(IDBS公司)4参数(bottom，top，IC50，hill slope)模型计算化合物IC50值.

1.2.3 抑制剂类型的研究

1.2.4 细胞培养

用含10%胎牛血清的IMDM培养基，于37℃，5% CO2的培养箱中培养KM12细胞和NCI-H1975细胞，以0.25%胰酶消化细胞进行传代培养.

1.2.5 细胞生长曲线的测定

KM12细胞均匀吹散，制备成细胞悬液，用Vi-cell计数细胞密度，将细胞按照3000/孔、2000/孔、1500/孔、1000/孔、800/孔、600/孔、500/孔、400/孔、300/孔、200/孔和100/孔的密度接种至384孔板.将细胞板放在Incucyte仪器中连续培养一周，设置为每隔6h读板1次.

1.2.6 化合物对细胞增殖的影响

取对数生长期的KM12细胞，调整细胞浓度为2×104/mL，接种50μL至384孔板中，1000/孔.利用Bravo仪器将化合物稀释至终浓度为10000，3333，1111，370，123，41，13.7，4.57，1.52，0.51nmol/L，对照组为等体积的DMSO，于37℃，5% CO2的培养箱72h.随后加入30μL CellTiter-Glo试剂，培养10min，Envision多功能酶标仪检测[15].联合用药实验中，将化合物Crizotinib横向稀释至终浓度20000，6667，2222，741，247，82.3，27.4，9.1，3.0，1.0nmol/L，将化合物Entrectinib纵向稀释至终浓度20，10，5，2.5，1.25，0.625nmol/L.充分混合后加入到细胞中进行增殖抑制效果的分析[16].

2 结 果

2.1 TRK激酶小分子抑制剂候选化合物的筛选与机制分析

为了快速获得潜在的TRK激酶抑制剂，我们首先利用HTRF方法进行TRK-A/B/C激酶抑制剂的初步筛选.HTRF是均相时间分辨荧光技术的简称，对时间分辨荧光(TR-FRET)技术进行改进，提高了灵敏度和稳定性.它的发射波长为665nm和615nm，能够很好的避免化合物本身自发荧光对实验的干扰[17].本研究的TRK激酶反应均在“稳态”中进行，该条件下化合物对激酶的抑制作用更为敏感.同时，用已知的TRK抑制剂Entrectinib作为实验的阳性对照.以化合物浓度为10μmol/L时抑制率大于50%为筛选标准，初步获得了26个化合物.

注： 各抑制剂均为ATP竞争性.

为了进一步确定化合物的抑制作用，我们对初筛阳性化合物进行了IC50的测定，结果如表1所示.除了阳性对照Entrectinib，IC50值(TRK-A)小于20nmol/L的化合物共计7个，包括已有相关报道的Crizotinib和6个新颖的化合物.其中，LY2874455是3种TRK激酶的全抑制剂，且抑制作用与阳性化合物Entrectinib相当.GSK-2256098和Dovitinib对3种TRK激酶的抑制作用也都强于Crizotinib.

我们进一步选择了对TRK-A激酶的IC50小于10nmol/L的5个化合物(Crizotinib、Dovitinib、GSK-2256098、LY2874455和AZD4547)的作用机制进行研究，结果如表2所示.利用GraphPad Prism 5软件mix mode inhibition模式分析化合物的作用机制，与Crizotinib一样，4个新颖的化合物也均属于ATP竞争性抑制剂，α值远大于10，且该模式计算出的Ki值与筛选测试的IC50结果一致.

图1 化合物Dovitinib对TRK-A激酶的竞争性抑制曲线Fig.1 Pattern of ATP competitive inhibitor Dovitinib tested against TRK-A

2.2 TRK激酶候选化合物能够抑制KM12细胞的增殖

结肠癌KM12细胞是第一个被发现存在NTRK基因融合的肿瘤细胞.它在1号染色体长臂上的原肌球蛋白-3基因TPM3与NTRK1发生了基因片段重排，异常表达TPM3-TRK-A嵌合蛋白[18].因此，我们进一步用筛选出的TRK激酶抑制剂处理KM12细胞，在细胞水平进一步筛选能够抑制KM12细胞增殖的有效抑制剂.为评估候选化合物的特异性，我们同时选择了NTRK基因正常表达的人肺癌NCI-H1975细胞作为对照.

将化合物作用于细胞72h，然后用CellTiter-Glo方法进行细胞增殖速率的检测.如表3所示，在生化水平中筛选出的6个新颖的化合物对KM12细胞的增殖也有显著的抑制作用，其IC50值均小于0.5μmol/L.其中，LY2874455的抑制作用最为显著，IC50为26nmol/L，抑制效果接近阳性化合物Entrectinib.镜下观察发现，随着化合物浓度的增加和药物作用时间的延长，KM12细胞大量死亡，细胞数量明显减少.化合物对阴性对照NCI-H1975细胞的抑制作用不明显，LY2874455对NCI-H1975细胞的IC50值为676.5nmol/L，与KM12细胞相比，约有30倍的选择性.其余化合物IC50值均大于3000nmol/L，与阳性化合物Entrectinib相当，提示这些化合物都具有较高的靶细胞选择性.

2.3 Crizotinib和Entrectinib联合用药可增强Entrectinib对KM12细胞增殖的抑制作用

在临床试验中，Crizotinib对NTRK基因融合型的肿瘤患者具有抑制肿瘤生长，肿块加速变小等显著的治疗效果，但是由于药物剂量太大，病人出现了胸痛、水肿等一系列的不适应症.患者停止服用Crizotinib，更换服用Entrectinib药物后，水肿等不适症逐渐消失并且患者的肿瘤能够继续变小[19].这一现象提示了Crizotinib和Entrectinib联合用药的潜在效果.为了验证这一猜想，我们将两个药物同时作用于NTRK基因融合型的KM12细胞，运用Combenifit和Calcusyn软件分析两种化合物联用对细胞增殖的协同抑制作用.Crizotinib和Entrectinib联合作用于KM12细胞72h后，细胞的存活率见图2(a)(见第180页)，随着药物浓度的增加，细胞存活率(η细胞)显著下降.在图2(b)、(c)中，Crizotinib在27.4nmol/L和82.3nmol/L两个浓度下与Entrectinib的联用效应数值大于0，提示两者在该浓度下协同作用较为显著.进一步运用Calcusyn软件分析两药联合的协同作用，如图2(d)所示，两者联用的CI(Combination Index)值，Crizotinib在9.14nmol/L、27.4nmol/L、82.3nmol/L和247nmol/L的浓度条件下，与Entrectinib联用均具有协同作用，在27.4nmol/L和82.3nmol/L两个浓度下效果比较明显，尤其在Entrectinib为1.25nmol/L和0.63nmol/L的浓度时，CI值小于0.5，协同作用很显著，且Crizotinib和Entrectinib的浓度都较低，细胞毒性较弱.

图2 Crizotinib与Entrectinib联用对KM12细胞增殖的影响Fig.2 Combination of Crizotinib and Entrectinib inhibit KM12 cell proliferation

3 讨 论

本研究中，分别利用TRK-A/B/C激酶的生化筛选平台和TPM3-NTRK1基因融合KM12细胞的细胞筛选平台，以Entrectinib为阳性对照，筛选得到了Crizotinib及6个新颖的小分子抑制剂.在TRK激酶生化筛选平台中，我们选择了HTRF检测方法，该方法检测两个发射波长，能够有效的避免化合物荧光吸收和自发荧光对实验的干扰，大大减少了假阳性或假阴性化合物的风险.在激酶反应条件中，TRK-A/B/C激酶用量都很低，均小于1nmol/L，大大的提高了化合物的检测限度.筛选出的新颖的小分子抑制剂都是酪氨酸激酶抑制剂，如Crizotinib是间变性淋巴瘤激酶(Anaplastic Lymphoma Kinase, ALK)抑制剂；VS-6063和GSK-2256098是局部粘着斑激酶(Focal Adhesion Kinase, FAK)抑制剂；Dovitinib、AZD4547和BIBF1120均是成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast Growth Factor Receptor, FGFR)、血小板衍生生长因子受体β(Platelet-Derived Growth Factor Receptor beta, PDGFRβ)、血管内皮细胞生长因子受体(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor, VEGFR)抑制剂；LY2874455是FGFR1/2/3/4的全抑制剂，本研究中发现其在生化和细胞水平都表现出强烈的抑制作用，且与Entrectinib效果相当[20].已有研究揭示一个激酶抑制剂可能同时抑制两个或两个以上的激酶，并表现出协同抑制肿瘤细胞生长、增殖的可能性[4].

在临床试验中，ETV6-NTRK3基因融合型的乳腺癌患者先服用Crizotinib药物3周后，肿瘤减小了3%；服用Crizotinib药物10周后，肿瘤减小了19%；而18周后，患者出现了胸痛、水肿等一系列的不适应症.患者停止服用Crizotinib，更换服用Entrectinib药物4周后，水肿等不适症基本消失；服用Entrectinib药物13周开始，患者的肿瘤开始退化变小；21周后，肿瘤减小了89%[19].在体外细胞水平上，Crizotinib与Entrectinib联合作用于KM12细胞，结果表明两药联用具有协同抑制KM12细胞增殖的效果.这个结果为进一步在动物实验中两药联用打下了基础，同时为Entrectinib与其他抑制剂的联用提供了思路.

综上所述，本研究筛选的小分子抑制剂将为TRK激酶抑制剂的开发提供更多的选择，Crizotinib与Entrectinib联合效果为后续的动物体内药效以及临床药物治疗提供一定的依据.