下调长链非编码RNA LINC00483抑制结肠癌细胞侵袭转移的研究

闫颜 汪茜 秦宝丽

(中国医科大学肿瘤医院/辽宁省肿瘤医院肿瘤内科，辽宁 沈阳 110042)

作为消化系统常见的恶性肿瘤之一，结直肠癌是第三常见的导致癌症相关死亡的疾病[1]。长链非编码RNA(lncRNAs)是一大类长度超过200个核苷酸的不具备编码蛋白质能力的RNA转录物。lncRNAs在包括炎症、动脉硬化、自身免疫性疾病、肿瘤等多种疾病中均发挥了重要的调控作用[2-3]。文献[4-6]报道，包括分化拮抗非编码RNA(DANCR)，肺腺癌转移相关转录物1(MALAT1)，浆细胞瘤易位变体1(PVT1)，非活性X特异性转录物(XIST)，转化生长因子-β激活(ATB)等多个lncRNAs均参与到结直肠癌的包括增殖、凋亡、侵袭转移等多种病理学过程中。目前关于长基因间非编码RNA 483(LINC00483)在结直肠癌中表达及作用的报道极少。本研究将初步探讨LINC00483在结直肠癌组织及细胞中的表达并研究其对结直肠癌细胞系HT29及LOVO细胞侵袭转移能力的影响。

1 材料与方法

1.1材料 收集3例2018年1月至2018年2月期间行结肠癌切除术中切取的新鲜结直肠癌组织及配对的癌旁组织标本，所有标本于切除后立即用液氮保存运送并进行相关检测；同时收集67例2015年1月至2018年1月期间行结肠癌切除术患者的福尔马林固定并石蜡包埋的(FFPE)结直肠癌组织及配对的癌旁组织标本。患者均经病理学检查证实诊断为结肠癌和或直肠癌。患者男38例，女32例，年龄51～75岁，平均年龄64.3岁，所有患者术前均未接受放疗或化疗。细胞系：人正常肠上皮细胞系NCM460和人结肠癌细胞系HT29及LOVO购自中科院上海细胞库。

1.2主要试剂 RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司；青霉素、链霉素购于上海宝曼生物科技有限公司；TRIzol及Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；QIAGEN FFPE RNeasy试剂盒购于德国QIAGEN公司；反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒购于德国Roche公司；Transwell小室购自美国Corning公司；特异性LINC00483探针、特异性LINC00483干扰寡核苷酸(siLINC00483-01和siLINC00483-02)及错义对照寡核苷酸(siscramble，siSCR)均由广州锐博生物科技有限公司设计合成；免疫原位杂交试剂盒购于美国BioChain公司；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3实验方法

1.3.1细胞培养及细胞转染 人正常肠上皮细胞株NCM460及人结肠癌细胞株HT29和LOVO均接种于添加10% FBS、100 IU/mL青霉素和100 mg/mL链霉素RPMI1640培养基进行培养，并置于37 ℃、5% CO2培养。待细胞融合率达80%时，以0.25%胰蛋白酶消化并传代。对于细胞转染，取生长状态佳的HT29和LOVO细胞调整密度为2×105个细胞/孔接种于6孔板中，24 h后，利用Lipofectamine2000将siSCR及siLINC00483-01或siLINC00483-02分别转染至HT29和LOVO细胞中，具体操作严格按照转染试剂盒说明书进行。48 h后进行后续的qRT-PCR和transwell实验。

1.3.2qRT-PCR检测LINC00483的表达 参照Trizol说明书提取组织及细胞的总RNA并分组标记；参照FFPE试剂盒说明书提取石蜡包埋的结肠癌及癌旁组织标本的总RNA。取5 μg总RNA进行逆转录反应以合成cDNA，反应产物按实时荧光定量PCR试剂盒说明书进行PCR扩增，设定GAPDH作为内参，具体反应条件如下：95 ℃预变性15 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共45个循环。引物序列如下：LINC00483上游，5’-GCTGAACCGGAACAGGACAT -3’，LINC00483下游5’-CCAGTTCACAGCAACTCACG-3’；GAPDH上游 5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC -3’，GAPDH下游5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。采用2-ΔΔCt法计算LINC00483的表达并分别与各自的对照组(Paratumor组、NCM460组及siSCR组)比较并计算LINC00483的相对表达量。

1.3.3免疫原位杂交检测LINC00483表达[7]将新鲜的结肠癌组织切片置于0.5% Triton X-100的1×PBS清洗液中清洗透膜，并置入含有1% 封闭液及LINC00483特异性探针的杂交液的湿盒中，将湿盒置入37 ℃孵箱中孵育过夜。次日分别用含有4×、2×及1×的0.1% Tween-20的柠檬酸钠缓冲溶液依次清洗切片3次，5 min/次。室温PBS清洗3次，DAPI复染，光学显微镜观察。

1.3.4Transwell实验检测HT29及LOVO细胞侵袭转移能力[7]常规包被底部膜，水化，对于侵袭实验，采用Matrigel凝胶包被上室基膜。将分别转染siSCR和siLINC00483-01/siLINC00483-02 48 h的HT29和LOVO细胞接种于Transwell上室内，接种密度为5×104个/孔。在上室内加入100 μL含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，下室内加入500 μL含20%胎牛血清的RPMI1640培养基，并置于37 ℃、5% CO2的孵箱中孵育。48 h后取出Transwell小室，棉签拭去Transwell小室内部细胞，冲洗、固定、染色后倒置显微镜下观察并计数穿膜细胞数。每组铺6个Transwell 小室，取其平均值。

2 结 果

2.1LINC00483在结肠癌组织中表达增高 3例新鲜的结肠癌及癌旁组织采用免疫原位杂交检测LINC00483的表达，见图1a，相比于癌旁组织，LINC00483在结肠癌组织中表达明显增高(***P<0.01)；同时，采用qRT-PCR法检测了LINC00483在70例结肠癌标本中的表达情况。见图1b，相比于癌旁组织，LINC00483在绝大部分(94.29%，66/70)结肠癌组织中表达明显高于癌旁组织。

注：***P< 0.01。

图1LINC00483在结肠癌组织中表达增高

2.2LINC00483在结肠癌细胞系中表达增高 结果显示，与组织学水平的检测结果相类似，相比于人肠正常上皮细胞系NCM460，LINC00483在结肠癌细胞系HT29及LOVO的表达明显增高(***P<0.01)，见图2。

注：***P< 0.01。

图2qRT-PCR法检测 LINC00483在结肠癌细胞系及正常肠上皮细胞系NCM460中的表达

2.3转染LINC00483 siRNAs可抑制LINC00483的表达 见图3，相比于转染scramble siRNA(siSCR)组，转染LINC00483 siRNAs(siLINC00483-01和siLINC00483-02)后，LINC00483在HT29及LOVO细胞内的表达均受到了明显抑制(**P< 0.01)。

注：**P< 0.01。

图3转染LINC00483 siRNAs可抑制LINC00483在结肠癌细胞系中的表达

2.4下调LINC00483可抑制结肠癌细胞侵袭转移 应用Transwell实验检测下调LINC00483对结肠癌细胞HT29及LOVO侵袭转移能力的影响。见图4，下调LINC00483明显削弱了HT29及LOVO细胞的侵袭转移能力(**P<0.01)。

图4 下调LINC00483可抑制结肠癌细胞HT29及LOVO侵袭转移

3 讨 论

lncRNAs是隶属于非编码RNA家族的一类长度超过200个碱基的长链大分子RNA转录物[8]。越来越多的证据表明LncRNAs广泛参与修饰肿瘤的多个生物学行为过程，包括肿瘤细胞的增殖、凋亡、自噬、侵袭转移等等[9-10]。LncRNAs可通过作为支架或向导调控蛋白与基因的相互作用，也可通过“海绵”的方式与微小RNA(miRNA)或蛋白相结合，还可作为增强子修饰其下游靶基因的转录[11-13]。一些矛盾表达的lncRNAs可通过作为癌基因或者抑癌基因的方式对肿瘤的发生和发展起到重要的调控作用[7，14]。

长基因间非编码RNA 483(LINC00483)位于人染色体17q21.33，全长共825个碱基。目前有关LINC00483的相关报道极少。D.Li等[15]发现LINC00483在胃癌组织及细胞系中表达增高，LINC00483可通过吸附内源性抑癌基因miR-30a-3p的方式提升精子相关抗原9(SPAG9)的表达并促进胃癌细胞的增殖及侵袭转移。本研究发现，LINC00483在结直肠癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织；且其在结直肠癌细胞系HT29及LOVO中的表达同样高于人正常肠上皮细胞系NCM460。也就是说LINC00483在结直肠癌中的表达升高。

结直肠癌的远处转移尤其是肝转移和肺转移是影响其预后的一个重要因素，Y.Wang等[7]研究报道，LncRNAs DANCR在结直肠癌中表达增高，DANCR可通过作为miR-577的竞争性内源性RNA(ceRNA)的方式调节热休克蛋白27(HSP27)的表达并促进结直肠癌细胞增殖及侵袭转移。Chen DL等研究发现，LncRNAs XIST在结直肠癌中表达增高，高表达的XIST与结直肠癌病人的不良预后密切相关，XIST可通过抑制miR-200b-3p的方式提高锌指E-盒结合同源异形盒1(ZEB1)的表达并促进ZEB1介导的结直肠癌侵袭转移[16]。本实验首先通过RNAi的方式下调了LINC00483在HT29及LOVO细胞中的表达，qRT-PCR检测结果显示转染LINC00483 siRNAs(siLINC00483-01和siLINC00483-02)后，HT29及LOVO细胞中LINC00483的表达明显降低，证实转染获得了成功。进一步通过Transwell实验考察LINC00483对结直肠癌细胞HT29及LOVO侵袭转移能力的影响。本研究结果显示，相比于转染siSCR组，转染siLINC00483组细胞的侵袭及迁移能力均明显降低，也就是说下调LINC00483可明显抑制结直肠癌细胞HT29及LOVO侵袭转移。

同其他多数恶性肿瘤一样，结直肠癌的侵袭转移过程是一个多通路多因子共同作用的复杂的病理学过程。lncRNAs发挥作用的机制很多也较为复杂，其下游的分子众多。本研究仅仅初步检测了LINC00483在结直肠癌中的表达情况并初步探讨了其对结直肠癌细胞侵袭转移能力的影响。将进一步的研究中深入探讨LINC00483的具体作用机制并明确其可能调控或协同作用的靶分子，为分子靶向治疗结直肠癌提供新思路。