鸡马立克氏病病毒感染对鸡神经系统损伤的研究

周林宜，张艳萍，孙国荣，张 峰，于正浩，高玉龙，祁小乐，李 凯，王笑梅，刘长军

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽免疫抑制病创新团队，黑龙江 哈尔滨 150069)

鸡马立克氏病(Marek's disease，MD)是由血清1型鸡马立克氏病病毒(MDV-1)引起的一种以神经症状，免疫抑制和肿瘤为典型特征的高度接触性传染性疾病，是目前危害我国养禽业发展的主要疾病之一[1]。根据MDV-1的致病性可将其分为4种病原型，即温和型(Mild MDV，mMDV)、强毒型(VirulentMDV，vMDV)、超强毒型(Very VirulentMDV，vvMDV)和特超强毒型(Very Virulent Plus MDV，vv+MDV)[2]，不同毒力的病毒株感染鸡会造成不同的致病特征。早期研究表明MDV感染所引起的神经症状，如急性暂时性麻痹和持续的神经系统疾病与MDV的致病型有关，并且对中枢神经系统的趋向性是高毒力MDV病毒株(vvMDV和vv+MDV)的一致特征[3]。但关于不同毒力的MDV病毒株对鸡神经系统的不同损伤的分子机制的研究却很少。

研究病毒在体内的复制情况和对组织的损伤情况是了解MDV致病特征的重要方式，不同的病毒株在体内的复制情况和其造成的病理损伤存在相关性。为了进一步探究不同毒力的MDV病毒株对鸡神经系统的损伤，本研究选用MDV-1病毒株BS、WC1203、Md5、814和rMS感染4日龄的SPF鸡，检测病毒载量的动态变化，并在此基础上对不同病毒株感染鸡的中枢神经(脑)和外周神经(坐骨神经)进行病理学观察，为MDV-1造成的神经损伤的研究提供数据依据。

1 材料与方法

1.1 病毒株与实验动物 MDV-1M d5株购自ATCC；MDV-1病毒株BS、WC1203、814、rMS均由本实验室保存，实验所用病毒株具体特征见表1，一日龄SPF白莱航鸡购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。

表1 本实验用的MDV-1病毒株Table 1 MDV1 strains used in the study

1.2 主要试剂 Premix ExTaqTM(Probe qPCR)Kit和其它分子生物试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA提取试剂盒购自康宁生命科学有限公司；PBS购自哈尔滨兽医研究所动物疫病诊断与技术服务中心。

1.3 动物实验 将198只SPF鸡随机分为6组，每组33只，负压隔离器饲养。不同的6组鸡分别以1 000 PFU/只腹腔接种MDV-1病毒株 814、rMS、Md5、BS、WC1203和同等体积的PBS溶液。在病毒接种后 1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、17 d、21 d、25 d、28 d和35 d分别每组随机选择3只SPF鸡，采集其脑和坐骨神经。

1.4 SPF鸡脑和坐骨神经总DNA的提取 取1.3收集的不同病毒株感染的SPF鸡的脑组织和坐骨神经(各200 mg)剪碎，加入1 m L PBS混合后用高通量组织研磨仪研磨成匀浆，12 000 r/min，4℃离心5 min，吸取200μL上清液，按照DNA提取试剂盒说明书提取组织总DNA。

1.5 SPF鸡脑组织和坐骨神经中MDV病毒载量的测定 以1.4中提取的组织样品DNA为模板，利用本实验室前期建立的双重荧光定量PCR方法[4]检测病毒载量。数据采用MDV定量研究中常用的每百万细胞中的病毒拷贝数(拷贝/106cells)表示。将每百万细胞中的病毒基因组拷贝数的对数值，采用方差分析法进行统计学分析。

1.6 脑和坐骨神经处的组织病理切片观察 将不同病毒株感染后5 d和21 d收集的感染鸡的脑和坐骨神经组织经10%福尔马林(pH7.2)固定，24 h后梯度酒精脱水，用无水乙醇和二甲苯等体积混合液透明后进行石蜡包埋，制备石蜡切片后进行HE染色，镜检组织病理变化。

2 结果

2.1 不同病毒株在SPF鸡脑组织中的复制动力学特征 利用双重荧光定量PCR检测不同毒力的MDV-1病毒株在感染后不同时间点在SPF鸡脑中的病毒载量，结果显示，最早在感染后5 d BS株感染组SPF鸡脑组织中可以检出病毒，感染后7 d在各组SPF鸡脑组织中均能够检测到病毒，表明BS株在脑中具有最强的增殖能力，这与其具有更强的毒力相符合。在感染10 d及以后，强毒株组SPF鸡脑组织中的病毒载量始终显著高于弱毒株组(p＜0.05)；在感染中晚期，病毒株毒力与在感染鸡脑内的复制能力呈正相关。强弱毒均在感染后第10 d和第21 d出现两个复制高峰，强毒株组SPF鸡在感染后17 d其脑组织中的病毒载量最低，而弱毒株组SPF鸡脑组织在感染后14 d的病毒载量最低(图1)，表明强毒和弱毒在脑部的潜伏期和再激活的时间存在差异。接毒10 d后，强毒株间和弱毒株间在SPF鸡脑组织中病毒载量不存在显著差异(p＞0.05)，感染中后期，强毒间在SPF鸡脑组织中的复制能力与其毒力无相关性。

图1 5株MDV-1在SPF鸡脑组织中的复制动力曲线Fig.1 Replication kinetics of 5 MDV1 strains in brain of SPF chicken

2.2 不同病毒株在SPF鸡坐骨神经中的复制动力学特征 利用双重荧光定量PCR检测不同毒力的MDV-1病毒株在感染后不同时间点在SPF鸡坐骨神经中的病毒载量，结果显示，最早在感染后14 d在SPF鸡的坐骨神经中能够检测到MDV-1各病毒株，感染后21 d在SPF鸡的坐骨神经中的病毒载量达到最大值，此后814株在SPF鸡坐骨神经处的病毒载量逐渐下降，其它病毒株在SPF鸡的坐骨神经处病毒载量先下降后上升。各强毒株组在各时间点的病毒载量无明显差异(p＞0.05)，弱毒814株在感染后14 d、17 d和25 d与强毒在SPF鸡坐骨神经处的病毒载量无显著差异(p＞0.05)，而弱毒rMS在感染后21 d，25 d和35 d与强毒株的病毒载量无显著差异(p＞0.05)(图2)，表明不同的MDV-1病毒株在坐骨神经中的复制有相似的动力学特征，强弱毒在SPF鸡坐骨神经处的复制能力与其毒力无直接的关系。

2.3 不同病毒株造成脑和坐骨神经的组织病理学变化 对不同病毒株在感染后5 d和21 d的SPF鸡的脑组织和坐骨神经组织进行了组织病理学观察(图3)。结果可见在感染后5 d强毒株和弱毒株感染的脑组织切片均有一定程度的病理变化。强毒感染的脑组织呈现局部较多胶质细胞浸润(图3B)，弱毒感染的脑组织呈现局部较少胶质细胞浸润(图3A)。在感染后21 d，强、弱毒的病毒载量达到第二个高峰，强、弱毒株造成脑部的病理损伤有明显的差异：强毒株感染的脑组织呈现多量的小血管周围炎症性细胞浸润，皮质内大小不等的胶质细胞结节散在性分布(图3E)；弱毒株感染的脑组织呈现部分神经细胞肿胀、少量的小胶质细胞散在性浸润(图3D)。在感染后21 d，强、弱毒株在坐骨神经处的病毒载量达到峰值，此时强、弱毒株对坐骨神经造成的损伤有明显的差异：弱毒株未造成明显的病理变化(图3G)，而强毒株感染可造成神经纤维间少量的淋巴细胞浸润，神经纤维间弥漫性和局灶性的淋巴细胞浸润(图3H)，显示在感染后21 d，强毒株在SPF鸡的坐骨神经处的损伤强于弱毒株。以上结果表明在不同的时间点，强、弱毒株造成的脑组织和坐骨神经处的病理变化是不同的。

图2 5株MDV-1在SPF鸡坐骨神经的复制动力曲线Fig.2 Replication kinetics of 5 MDV1 strains in sciatic nerve of SPF chicken

3 讨 论

从20世纪50年代至今，MDV毒力不断增强。在中国，MDV毒力进化与世界公认的毒力进化过程基本一致。近年来，中国MDV新分离病毒株的致病性和致病特征出现了变化[5-6]。MDV感染所导致的神经症状主要是通过侵害外周神经和中枢神经引起的，MDV感染导致的典型神经症状主要是鸡外周神经中坐骨神经肿大和鸡中枢神经中脑部出现空泡[7]。本研究选取了3株具有不同致病特征和毒力的MDV-1强毒和2株弱毒通过检测其感染后SPF脑组织和坐骨神经病毒载量动态变化和组织病理损伤来研究不同类型的病毒株对神经系统的致病特征。其中BS株为中国分离病毒株，毒力高于标准超强毒株Md5，WC1203株则是毒力低于Md5株的中国分离株，814株为传代致弱的弱毒株，rMS株则是通过缺失致瘤基因Meq产生的弱毒。前期研究表明MDV-1的毒力越强，在感染前期其在体内的复制速率越快，病毒载量越高[8]。而MDV-1在体内羽髓和淋巴细胞中复制动力学分析验证了这一规律，即MDV-1的致病性与其复制能力成正比[9]。本研究结果显示虽然毒力最强的BS株早期在SPF鸡脑组织中的复制速度最快，检测到的时间最早，但在感染7 d后，3株强毒的病毒载量并无显著差异；在感染10 d后，强毒的病毒载量显著高于弱毒。弱毒的病毒载量之间也无显著差异。推测BS株早期在SPF鸡脑组织中的复制速度最快与其毒力最强有直接的关系。之前也有研究显示，虽然MDV-1超强毒株YL040920和弱毒株CVI988均可以感染鸡的脑小胶质细胞，但YL040920的病毒载量低于CVI988株[10]，表明MDV-1不同毒力的病毒株在脑组织中的复制规律与在其它组织器官中略不相同。本研究发现MDV-1不同毒力的病毒株在坐骨神经中的复制规律和在脑组织中截然不同，虽然MDV-1在感染早期就会出现一过性的“劈叉”等症状[11]，但MDV-1的不同病毒株在感染后14 d才在坐骨神经处检测到病毒，并且不同毒力的病毒株在坐骨神经处的复制能力与其毒力无直接关系。脑和坐骨神经分别是鸡的中枢神经系统和外周神经系统，本研究结果表明MDV在鸡的中枢神经和外周神经中的复制规律不一样，这可能是两种器官的差别造成的。

图3 脑和坐骨神经的组织病理学变化Fig.3 Histological lesions of brain and sciatic nerve in MDV1 infected chickens

基于MDV-1不同病毒株在脑和坐骨神经处的复制特征，本研究对感染后不同时间点的脑和坐骨神经进行了组织病理学观察。有研究表明鸡脑组织中的MDV的复制与病变的发展密切相关，特超强毒株648A比强毒株GA对脑组织的病理损伤更为严重，在脑组织中的病毒载量更高[12]。但本研究显示在感染后5 d和21 d，不同毒力的强毒株所造成的脑部损伤基本一致。分析认为，虽然BS株属于vv+MDV，但它具有“晚毒力”的特点，因此早期在脑部造成的损伤与其它强毒株未呈现出显著的差别[6]。两株弱毒造成的脑部病理损伤基本一致，在感染后5 d，强毒所造成的病理损伤稍强于弱毒株，而在感染后21 d，强、弱毒株造成的病理损伤存在明显区别，与病毒载量的差异表现基本一致。在感染后21 d，强毒株在坐骨神经处造成的损伤更为严重，弱毒株无明显病理损伤，与病毒载量的差异不一致。这些结果表明不同毒力的病毒株在神经系统造成的损伤与其毒力和复制能力有相关性，但并不完全成正比。对于不同毒力的病毒株在脑部和坐骨神经造成的病理损伤与其毒力和病毒载量的关系，需要进一步研究。本研究揭示了不同毒力的MDV-1在SPF鸡脑组织和坐骨神经中的复制动力学特征和组织病理学特征，为进一步研究MDV-1造成的神经损伤提供了实验基础。