小RAN干扰Trx1促进大鼠缺血再灌注损伤的星形胶质细胞凋亡、抑制其增殖及作用机制

欧阳波 陈勇军 唐小容 张衡生 纪雄英

(南华大学附属南华医院 1中医康复科，湖南 衡阳 421002；2腔镜室；3神经内科)

缺血再灌注损伤发生时，脑组织内氧化反应异常，机体内自由基得到积累，引起细胞内能量代谢障碍、DNA断裂等，最终促进神经细胞凋亡〔1～4〕。神经细胞凋亡在脑缺血再灌注损伤机制的研究中发挥重要作用。探究中断脑缺血诱导神经细胞的凋亡这一级联反应的潜在靶点是目前研究的热点和重点。硫氧还蛋白(Trx)1，具有强大的抗氧化和抗凋亡作用〔5〕，但目前关于Trx1调控神经细胞凋亡的具体作用机制仍不清楚。本实验探讨Trx1对氧糖剥夺的星形胶质细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 SD大鼠(出生48 h内)购自北京维通利华实验动物有限公司，雌雄不限，体重10～13 g。

1.2主要试剂和仪器 DMEM培养基、胰酶、胎牛血清购自美国Gibco公司，反转录试剂盒、细胞裂解液购自北京康为试剂生物科技有限公司，Lipofectamine 2000转染试剂盒、Trizol、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Invitrogen公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、膜联蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡试剂盒购自上海碧云天生物技术公司，Trx1抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3抗体、活化的(Cleaved)Caspase-3抗体、B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体购自美国Cellular Signaling Technology公司。

1.3细胞的培养 根据参考文献〔6〕，收集并鉴定大鼠原代星形胶质细胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基中，放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中，每隔2 d更换一次培养基，其细胞浓度达到70%～80%，加入胰酶消化，以1∶2或1∶3的比例进行传代。

1.4缺血再灌注损伤模型的构建 选取生长状态良好的星形胶质细胞，以每孔5×105个细胞接种于6孔板中，置于培养箱中培养24 h，更换为不含血清的培养基，5%CO2、95%N2环境中培养6 h，弃去培养基，加入含10%胎牛血清的新鲜培养基，5%CO2的培养箱中复氧24 h，以正常培养的细胞作为对照，进行后续实验。

1.5细胞的转染 将星形胶质细胞分为4组，对照组、氧糖剥夺(OGD)模型组、小干扰(si)RNA-NC组、siRNA-Trx1组。转染前24 h，选取生长状态良好的星形胶质细胞，调整为5×105个，待细胞浓度达到80%～90%开始转染。将培养基更换为Opti-MEM，稀释A液：将siRNA和Lipofectamine 2000分别与Opti-MEM培养基混合均匀，室温孵育10 min；然后将两稀释液充分混合，室温静置5 min，每孔细胞中加入上述复合物，37℃培养4～6 h，更换为完全培养基。

1.6实时荧光定量PCR(qPCR) 收集5×105个细胞，加入1 ml Trizol提取细胞中总RNA，反转录为cDNA。以GAPDH为内参，cDNA为模板，进行扩增。引物由上海生工生物有限公司合成，Trx1引物上游序列为5′-CCTTCTTTCATTCCCTCTGTGA-3′，下游序列为5′-CCCAACCTTTTGACCCTT TTTA-3′。反应条件为95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃ 15 s，40个循环。实验重复3次，结果采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.7MTT检测细胞的增殖 将各组星形胶质细胞密度调整5×103个，接种与96孔板上，培养48 h，每孔加入50 μl MTT，37℃孵育4 h后，每孔加入150 μl DMSO，摇床中振荡10 min，酶标仪检测细胞490 nm波长的吸光值。

1.8流式细胞术检测细胞的凋亡 根据凋亡试剂盒说明书所示，收集各组细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1次，加入100 μl细胞缓冲液，加入Annexin V-FITC和PI，避光，4℃染色15 min，然后加入400 μl细胞缓冲液，流式细胞仪分析各组细胞的凋亡率。

1.9免疫印迹实验 弃去培养液，预冷的PBS清洗3次，加入适量细胞蛋白裂解液，冰浴15 min，收集上清即为细胞总蛋白。BCA试剂盒法测定蛋白质浓度。取200 μl蛋白样品，沸水加热5 min，使蛋白充分变性；加入电泳液，吸取40 μg总蛋白加入上样孔，上层胶电压为80 V，电泳30 min，下层胶电压为100 V，电泳100 min。根据目的蛋白分子量大小，切凝胶带，依次放入滤纸、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、凝胶、滤纸，恒定电压105 V转膜105 min；将PVDF膜置于封闭液中，轻轻摇动1 h；加入一抗，4℃孵育过夜，TBST漂洗3次×10 min，加入二抗，37℃孵育1 h，TBST漂洗3次×10 min，避光，加入电化学发光(ECL)液，凝胶成像仪中拍照，Quantity One软件分析蛋白质灰度值。

1.10统计学分析 SPSS22.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组细胞中Trx1基因的表达量比较 OGD模型组、siRNA-NC组、siRNA-Trx1组Trx1 mRNA表达量较对照组显著增加(P<0.05)；与OGD模型组相比，siRNA-NC组Trx1的表达量差异无统计学意义(P>0.05)，siRNA-Trx1组星形胶质细胞中Trx1 mRNA表达量显著降低(P<0.05)。见表1。

2.2下调Trx1基因的表达量对星形胶质细胞增殖的影响 与对照组相比，OGD模型组、siRNA-NC组、siRNA-Trx1组星形胶质细胞增殖显著下降(P<0.05)；与OGD模型组相比，siRNA-NC组星形胶质细胞增殖差异无统计学意义(P>0.05)，siRNA-Trx1组星形胶质细胞增殖显著降低(P<0.05)。见表1。

2.3下调Trx1基因的表达量对细胞凋亡的影响 与对照组相比，OGD模型组、siRNA-NC组、siRNA-Trx1组细胞凋亡率显著增加(P<0.05)；与OGD模型组相比，siRNA-NC组星形胶质细胞凋亡率无显著变化(P>0.05)，siRNA-Trx1组星形胶质细胞凋亡显著增加(P<0.05)。见表1。

表1 各组Trx1基因表达、细胞增殖、细胞凋亡及凋亡相关蛋白水平比较

与对照组相比：1)P<0.05；与OGD模型组相比：2)P<0.05

2.4下调Trx1基因的表达量对星形胶质凋亡相关蛋白水平的影响 各组Caspase-3蛋白的表达量差异无统计学意义(P>0.05)；与对照组相比，OGD模型组、siRNA-NC组、siRNA-Trx1组细胞中Cleaved Caspase-3蛋白、Bax蛋白的表达量均显著增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白的表达量显著降低(P<0.05)；与OGD模型组相比，siRNA-NC组星形胶质细胞中凋亡相关蛋白无显著变化(P>0.05)，siRNA-Trx1组星形胶质细胞中Cleaved Caspase-3蛋白、Bax蛋白的表达量显著增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白的表达量显著降低(P<0.05)。见表1、图1。

1～4：对照组、OGD模型组、siRNA-NC组、siRNA-Trx1组图1 Western印迹检测各组Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Caspase-3蛋白表达

3 讨 论

星形胶质细胞是神经细胞的重要成员之一，有助于维持中枢神经系统结构和功能的完整性。研究表明，星形胶质细胞具有多种生理功能，比如调节神经系统的新陈代谢、处理细胞外的有毒物质、对血管结构完整性的维持、调控神经突触的生成和递质的释放〔7～10〕。脑缺血再灌注损伤过程中，星形胶质细胞功能紊乱进一步促进神经元的损伤，因此，探究脑缺血再灌注损伤过程中减少星形胶质细胞的凋亡具有重要的作用。研究表明，氧糖剥夺损伤促进星形胶质细胞的凋亡〔11〕。研究表明，Trx1具有抗凋亡和氧化、降低炎症反应、保护脑缺血再灌注损伤和调节蛋白质结构等作用。在Trx1表达量上调的转基因小鼠中，通过构建大脑中动脉缺血模型发现，模型小鼠的受损区显著小于对照组，神经细胞的凋亡率明显降低〔12〕。在脑缺血过程中，星形胶质细胞发生氧化应激损伤的程度显著小于神经元，其中Trx1的基础活性及诱导水平均显著增加〔13〕。本实验结果表明，Trx1可抑制氧糖剥夺损伤的星形胶质细胞凋亡、促进其增殖，从而对脑缺血损伤发挥保护作用。

在细胞的凋亡过程中，Bcl-2、Bax与凋亡发生、发展密切相关。Bcl-2、Bax表达量的变化决定细胞凋亡程序是否启动，其中Bcl-2在细胞凋亡过程中发挥抗凋亡的作用，其表达量的增加会抑制细胞的凋亡率；Bax在细胞凋亡过程中发挥促凋亡作用，其表达量的增加会促进细胞凋亡〔14～16〕。研究表明Bcl-2、Bax参与过氧化氢诱导的星形胶质细胞凋亡调控过程〔17〕。体外共培养间充质干细胞和星形胶质细胞，其中间充质干细胞分泌的白细胞介素6阻碍氧糖剥夺的星形胶质细胞的凋亡，其作用机制与促进星形胶质细胞中Bcl-2的表达量和降低Bax的表达量密切相关〔18〕。Caspase-3是细胞凋亡过程中重要的蛋白酶之一，是多种细胞介导的凋亡信号通路的共同下游靶蛋白，使细胞凋亡过程中蛋白级联反应的枢纽〔19，20〕。本研究经过构建氧糖剥夺损伤的星形胶质细胞，发现Bcl-2蛋白水平明显降低，Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平显著增加，而抑制Trx1表达量后，星形胶质细胞中Bcl-2蛋白水平进一步降低，Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平进一步增加，表明氧糖剥夺损伤后抑制Trx1表达，可通过调节Bcl-2/Bax/Cleaved Caspase-3信号通路蛋白的表达量促进细胞的凋亡、抑制细胞增殖。

综上，抑制氧糖剥夺损伤后的星形胶质细胞中Trx1表达量，显著促进细胞凋亡，抑制细胞增殖，其作用机制可能是通过调控Bcl-2/Bax/Cleaved Caspase-3信号通路蛋白表达量发挥作用。