孤独症谱系障碍患儿相关候选基因研究

许晶莉， 范艳萍， 高晶

孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder，ASD)是一组以社会交往障碍、言语和非言语交流障碍、狭隘兴趣、刻板行为为主要特征的神经发育障碍性疾病。近年来，ASD发病率显著上升，2014年，美国疾病预防控制中心公布的最新ASD患病率为1/68，已占精神残疾的首位[1]。目前，ASD的病因不明，越来越多的证据表明，遗传因素在ASD的发病中起着重要作用[2]。基因芯片技术是生物芯片技术的一种，是生命科学领域里兴起的一项高新技术，其在基因组的表达分析、遗传疾病基因诊断、病原微生物的诊断等方面都有广泛的应用，是一种高效、大规模获取相关生物信息的重要手段。本研究采用基因芯片技术对30例ASD患儿进行检测，旨在通过基因测序，探讨ASD患儿的遗传学特征。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年6月至2018年6月在深圳市龙岗区妇幼保健院儿童保健科进行康复的ASD患儿30例为观察组，其中男18例，女12例；年龄4～6岁，平均(4.61±0.25)岁。同期选择健康体检儿童20例作为对照组，其中男12例，女8例；年龄4～6岁，平均(4.88±0.30)岁。两组研究对象在性别、年龄方面比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 诊断标准 参照《美国精神障碍诊断和统计手册》第5版中ASD的诊断标准[3]。

1.3 纳入标准 (1)符合孤独症谱系障碍的诊断标准；(2)年龄4～6岁；(3)患儿家长知情同意。

1.4 排除标准 (1)并发癫痫；(2)听力异常；(3)发育性言语和语言发育障碍；(4)精神发育迟滞；(5)重大躯体和神经系统疾病；(6)遗传性疾病。

1.5 方法

1.5.1 标本采集 使用EDTA采血管，收集全体受试儿童的血液标本。

1.5.2 血液标本提取DNA (1)将冰冻血在室温下溶化；(2)取1 mL血液转入一无菌的2 mL离心管中，加入等体积的磷酸盐缓冲液，充分混匀后12 000 r/min离心5 min，弃上清；(3)加入667 μL STE，24 μL的20% SDS，37 ℃水浴1 h；(4)加10 μL的20 g/L的蛋白酶K混匀，55 ℃水浴消化过夜(10～14 h)；(5)将消化的样品加入等体积的Tris饱和酚，充分摇匀，12 000 r/min离心10 min；(6)将上层水相转入另一无菌2 mL离心管中；再加入等体积的Tris饱和酚，充分摇匀，12 000 r/min离心10 min；(7)将上层水相转入另一无菌2 mL离心管中；并加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，漩涡振荡至充分混匀，12 000 r/min离心10 min；(8)将上层水相转入另一无菌2 mL离心管中；并加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，充分振荡混匀，12 000 r/min离心10 min；(9)将上清液转移到另一无菌2 mL离心管中；加入2倍体积的冰乙醇，1/10体积醋酸钠水平摇动，直到可见絮状DNA析出；(10)将样品置-20 ℃冰箱冷冻30 min或冰浴15～20 min，取出后再次12 000 r/min离心10 min，使DNA沉淀；(11)用枪头将DNA挑到另一无菌离心管中，用适量的70%乙醇洗涤并晃动，以洗出DNA的杂质；(12)倒出乙醇，将DNA用真空干燥或自然晾干，加入适量的TE缓冲液回溶，-20 ℃保存备用。

1.5.3 DNA检测 将上述DNA进行列微阵技术检测，包括芯片方阵的构建、样品的制备、杂交反应。

1.5.4 信号分析 采用拷贝数分析算法分析拷贝数变化的共同特征，对全部受试儿童的3个SNP位点进行基因谱比较，寻找对照组与观察组之间的显著性基因表达差异。

1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计学处理,计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

3个SNP基因位点(re2711888、rs6967728、rs756505)的分型结果见表1。结果发现，两组基因表达谱比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 SNP基因位点的基因频率(n)

3 讨论

目前，ASD的病因不明。研究发现，ASD可能是一种多因素、多基因共同作用的诱发的疾病[4]。目前，在国内ASD患儿的诊断一般都在2～3岁后，此时其临床特征已经非常明显，从而失去了早期干预的最佳时机。采用基因芯片技术检测ASD的致病基因，有助于早期识别ASD，使患儿得到早期诊断及干预。近年来的遗传学研究大多集中在基因异常方面，很多学者已经发现了ASD的候选基因。对ASD的基因定位研究显示，SHANK3、SLC25A12、SCN2A2及GABRA4等基因多态性可能是ASD的疾病候选基因[4-6]，并且基于染色体基因水平的分析也证实，1q21.1,15q13.3,16p11.2,22q13.3等区域的基因数变异可能与ASD相关[7-8]。

基因芯片,也叫DNA芯片或DNA微阵列，基因芯片技术是20世纪90年代创建并发展起来的一项分子生物学技术[9]。虽然只有短短数十年时间，基因芯片技术已经得到了突飞猛进的发展。基因芯片技术通过分析杂交信号，就可知道不同情况每个基因是否已表达及表达水平如何。基因芯片技术在寻找新基因、定量检测大量基因表达水平、阐述基因功能、探索疾病原因及机制、诊断及治疗方面都是很有价值的。近年来，基因拷贝数变异正不断被应用于遗传性疾病研究。研究证实，基因拷贝数变异和表型变异紧密关联，在物种的演化和发展中发挥着重要作用[10]。因此，采用基因芯片技术探讨孤独症相关候选基因是可行的。

本研究结果并未发现ASD患儿基因表达谱的差异，原因可能如下：(1)表观遗传学的观点认为，在孤独症谱系障碍以及众多其他疾病中，可能并不必定存在DNA水平的突变和异常，但是可能在基因调控水平(主要是甲基化或组蛋白作用)出现了异常，从而导致在DNA表达方面的异常；(2)样本量过小，比较基因位点过少。在今后的研究中，我们将继续探索，扩大样本量，并筛选更多的ASD相关候选基因及SNP位点，做进一步的研究。