几种不同的化学预处理方法对甜高粱秆酶解糖化效果的影响

孙于庆,周 芳，康 静,冯 冲*

(1.郑州工程技术学院 化工食品学院，河南 郑州 450044；2.郑州市食品药品监督管理局，河南 郑州 450006；3.新乡医学院生命科学技术学院，河南 新乡 453003)

甜高粱是具有高光合作用能力、高还原糖得率和生物量的能源作物，也是唯一能够同时产出粮食、糖和生物质的作物[1]。甜高粱不仅光合效率高，而且对种植环境具有很强的适应性和抗逆性，在种植过程中，具有需求肥料量低、用水效率较高、生长周期较短等优点，是适合大面积推广种植的能源作物[2-6]。目前对于甜高粱的研究热点集中在从甜高粱秸秆中制取可发酵单糖。甜高粱秸秆经过水解糖化后可直接发酵生产燃料乙醇，是一种极具潜力的可再生生物质资源[7-10]。研究发现，甜高粱秸秆的主要成分为纤维素、半纤维素和木质素。木质素填充于纤维素和半纤维素之间，通过氢键和共价键与糖类聚合物连接在一起[11-13]，这种结构严重阻碍了纤维素的降解，合适的预处理过程是打破这种抗性的有效手段。虽然通过一系列的物理、化学以及生物过程来解决从木质纤维素中释放结构糖的问题，但是必须要面对成本高、基础设施条件要求高以及技术突破的挑战等现实情况[14-15]。比较理想的处理方法需要具备较低的资本和运营成本、最大限度地提高原料的利用率、 产生少量的酶抑制剂和发酵微生[16]。针对以上这些问题，本文选取几种化学物质，分别对甜高粱秸秆进行预处理，同时对酶水解糖化效果进行了研究，为充分利用甜高粱秸秆制备燃料乙醇提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

甜高粱秸秆：取自郑州郊区，切割粉碎30～40目；木聚糖酶及纤维素酶：购于上海杰能科酶制剂公司，其中木聚糖酶酶活1.76×106U/L，纤维素酶酶活2.07×106U/L。

葡萄糖标准液的配制：准确称取100 mg分析纯葡萄糖(预先在80℃烘至恒重)，置于小烧杯中，用少量的蒸馏水溶解后，定容转移到100 mL容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 化学预处理

3称取高粱秸秆粉10 g，加入250 mL的三角瓶中，按照固液比 110(W/V)的比例分别加入不同浓度梯度的盐酸、亚硫酸、甲酸、氢氧化钠以及双氧水与氢氧化钠的混合液混合均匀，于121℃高温条件下预处理60 min，冷却至室温。

1.2.2 酶解试验

高粱秸秆经过化学预处理后，调pH为5.0，加入纤维素酶2.5g/100g 和木聚糖酶2g/100g，MgCl2溶液2.5 nmol/L，吐温-80为1mL/100g，用蒸馏水补充，使固液比为110(W/V)，在50 ℃，160 r/min条件下糖化 48 h，每 10 h 补加一次酶并对物料进行预处理，共补加4 次。过滤，取滤液灭菌备用。

1.2.3 葡萄糖标准曲线的制作

取7支25 mL刻度试管，编号，将试管摇匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即冷却至室温，再以蒸馏水定容至25 mL，混匀。在540 nm波长下，分别读取其吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线，如图1所示。

图1 葡萄糖标准曲线

1.2.4 总糖含量测定

总糖含量测定采用3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)[17]。

2 结果与分析

2.1 盐酸预处理对甜高粱秸秆酶解糖化效果的影响

添加不同浓度梯度的盐酸(分别为0%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，3.5%)，考察盐酸预处理对秸秆糖化效果的影响，结果如图2所示。

图2 盐酸质量分数对秸秆糖化效果的影响

由图2可知，1.0%的盐酸预处理酶解后还原糖得率最高值达到29.1%，说明1.0%的盐酸预处理有利于纤维素酶和木聚糖酶的酶解作用。稀盐酸水解时，大部分半纤维素溶解于酸溶液中,双酶与纤维素的接触面积增加，使纤维素的双酶糖化率提高。

2.2 亚硫酸预处理对甜高粱秸秆酶解糖化效果的影响

添加不同浓度梯度的亚硫酸(分别为0%，1%，3%，5%，6%，7%，8%，9%)，考察亚硫酸预处理对秸秆糖化效果的影响，结果如图3所示。

图3 亚硫酸质量分数对秸秆糖化效果的影响

由图3可知，亚硫酸质量分数为6%时还原糖得率最高，为8.7%。显而易见，亚硫酸预处理酶解糖化效果较差，其作用机理有待于进一步研究。

2.3 甲酸预处理对甜高粱秸秆酶解糖化效果的影响

添加不同浓度梯度的甲酸(分别为0%，5%，10%，15%，20%，25%，30%)，考察甲酸预处理对秸秆糖化效果的影响，结果如图4所示。

图4 甲酸质量分数对秸秆糖化效果的影响

由图4可知，甲酸质量分数为15%时还原糖得率最高，为22.4%。

2.4 氢氧化钠预处理对甜高粱秸秆酶解糖化效果的影响

添加不同浓度梯度的NaOH(分别为0%，1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%)，考察NaOH预处理对秸秆糖化效果的影响，结果如图5所示。

由图5可知，NaOH质量分数为8%时还原糖得率最高，为24.3%。碱预处理的机理是在碱的作用下,木质素和其他半纤维素间的酯键发生皂化反应。碱预处理后的木质纤维素变得更具多孔性，增大了接触表面积，故碱预处理后的纤维素更易酶解[18]。经NaOH预处理后还原糖得率提高幅度较大，说明经NaOH预处理后双酶糖化的效果较明显。

图5 NaOH质量分数对秸秆糖化效果的影响

2.5 H2O2预处理对甜高粱秸秆酶解糖化效果的影响

添加不同浓度梯度的H2O2(分别为0%，1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%)，考察H2O2预处理对秸秆糖化效果的影响，结果如图6所示。

图6 H2O2质量分数对秸秆糖化效果的影响

由图6可知，H2O2质量分数为2%时还原糖得率最高，为11.5%。由于双氧水只含氢和氧，是比较绿色、环保的预处理试剂，但该研究的结果不太理想。据报道，双氧水与氢氧化钠混合预处理效果会更好，有待于进一步研究。

3 结论

探索了几种不同的化学物质预处理方法对秸秆双酶糖化效果的影响，发现影响程度最大的是1%的盐酸，第二是8%的氢氧化钠，第三是15%的甲酸，影响程度最小的是亚硫酸。最终确定了最佳预处理方案：1%(W/W)的稀盐酸在121℃高温条件下预处理60 min 后，加入纤维素酶2.5g/100g 和木聚糖酶2g/100g，MgCl2溶液2.5 nmol/L，吐温-80为1mL/100g，固液比为110(W/V)，pH5.0，50 ℃酶解糖化48 h。在此条件下还原糖得率最高，其值为29.1%。