分子标记辅助选择不同甜瓜性别植株

2019-05-09范磊戴冬洋熊安平盛云燕于明珠秦瑛聪

生物技术通报 2019年4期

范磊戴冬洋，2 熊安平盛云燕于明珠秦瑛聪

（1. 黑龙江八一农垦大学农学院，大庆 163319；2. 石河子大学农学院，石河子 832003）

甜瓜（Cucuumis meloL.）是葫芦科重要的经济作物之一，性别分化类型丰富，主要受两个基因控制——A基因和G基因［1，2］。G基因（WIP1）抑制心皮发育导致雄花发育。研究表明，CmACS7在甜瓜完全花早期发育过程中引起雄蕊退化，产生雌雄异花同株和全雌系［2］。其中全雌系植株的产生是由于一个hAT转录因子家族的插入而引起的［1］。甜瓜性别分化是甜瓜单性材料育种的重要理论依据，而甜瓜单性花育种是培育新品种的重要目标之一。但是，通过传统表型选择方法筛选单性甜瓜材料，不仅要求丰富的经验而且耗费大量的人力、物力，而且甜瓜性别分化容易受多条件限制，培育优良单性品种需花费7-8年甚至十几年时间。因此，提高选择的效率和减少育种过程中的盲目性是育种工作的关键。

分子标记辅助选择（Marker-assisted selection，MAS）可以从分子水平快速准确地分析个体的遗传组成。前人甜瓜QTL主效基因的定位和克隆进行了较多的研究［5-8］，但是应用到分子标记辅助选择育种过程中的标记较少。甜瓜性别分子标记研究较多［9-12］，主要集中在控制雄全同株Cm-Acs-7（A基因）基因位点，张乔玲等［10］甜瓜纯合单性花材料与两性花材料在CmACS-7（A）基因缺失位点开发出了InDel-1标记，用于甜瓜性别早期选择。李凤梅等［11］建立了甜瓜单性花Cm-ACS7分子标记体系。前期研究主要集中在单性花基因Cm-ACS7上，对于共同筛选A、G基因的报道相对较少。

本研究利用已经克隆的甜瓜2个性别基因，设计分子标记，在苗期，利用A和G基因鉴定甜瓜的性别类型，可以大大缩短选择育种的年限，加速分子聚合育种的进程，为甜瓜其他性状的分子标记辅助育种提供方法。

1 材料与方法

1.1 材料

甜瓜母本为WI998，厚皮网纹甜瓜，全雌系；父本为TopMark，厚皮网纹甜瓜，雄全同株，二者均来源于美国威斯康星大学瓜类遗传育种研究室。以单粒传的方式获得F8重组自交系群体，选择47个家系（以WT命名，按照顺序编号，每个家系种植12个单株）用于分子标记辅助选择，同时选择14份甜瓜材料为验证材料（表1）。

表1 供试甜瓜材料

1.2 方法

1.2.1 分子标记选择甜瓜两片真叶展开时的新鲜叶片组织，利用CTAB法提取DNA，DNA浓度为15-50 ng/L。根据 NCBI genbank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）公布的甜瓜 A 基因（CmACS-7，ID：103492295）和G基因（WIP1+Gyno-hAT，ID：103491671）序列设计引物，CmACS-7转化Caps标记，命名为Cmacs7，引物序列为F：5′-CAGTGGCACCAGCAGTTA-3′；R ：5′-GGAAAGCGTATGATGAAG-3′，利用AluⅠ对其产物进行酶切。G基因位点设计2个引物，区分是否含有Gyno-hAT插入位点的引物 Cmhat：F ：5′-ATGGCAGACAGATTGTTATTAGTG-3′；R ：5′-GAGTAGAAGGTACTCCAAATGAATGGC-3′；区分G（g）位点杂合与纯合性引物Cms，F ：5′-CGGTTCGGTCCAGTAACATT-3′；R ：5′-AGGGGGAAGAAAAAGGGATT-3′。

PCR反应体系采用10×扩增缓冲液1 μL（MgCl2+）、dNTPs（1 mmol/L）0.2 μL、引物（5 pmol/L）2 μL、模板 DNA（15-20 ng/μL）1 μL、Taq DNA 聚合酶（1 U/μL）0.1 μL，ddH2O 补至 10 μL。

PCR扩增程序为94℃ 30 s；94℃ 30 s，50-68℃30 s，72℃ 40 s，25个循环；72℃ 5 min。扩增产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，拍照。Cmacs-7扩增产物在37℃下酶切3 h。

1.2.2 田间性状调查 2013年、2014年及2018年分别种植验证材料及重组自交系群体，调查单株开花类型，记录植株性别：雌雄异花同株（雄花和雌花）、完全花植株（只着生完全花）、全雌株（只着生雌花）和雄全同株（雄花和完全花）；2013年及2014年调查甜瓜重组自交系群体家系每个单株主蔓30节前所有雌花、雄花及完全花的开花率，验证性别表现；2018年调查植株开花类型；对DNA分子标记检测结果进行验证。

2 结果

2.1 CmACS-7基因位点检测结果分析

利用CmACS-7标记对亲本、重组自交系群体及验证材料进行分析，所有供试材料在 383 bp产生一个位点，经ALUⅠ酶切3 h后，酶切产物分为3种类型（图1）。当PCR产物在383 bp被全部酶切，该位点所显示基因型为aa；当PCR产物不能被酶切时，该位点代表AA基因型，当酶切位点和PCR产物位点均有扩增条带时，代表基因型为Aa，呈杂合状态。

图1 甜瓜CmACS-7扩增产物检测

2.2 重组自交系群体G基因位点的检测

利用NCBI公布的Gyno-hat序列与WIP1序列，设计2对引物，以期区分纯合位点与杂合位点，基因结构示意图与引物设计原则如图2所示。由于插入3 kbGYno-hat序列，Cmhat引物扩增条带过大无法检测到，因此当Cmhat引物产生扩增条带（197 bp）时，说明该材料基因型为G，而该位点无产物则基因型为g；在gyno-hat共有序列WIP1连接处设计引物Cms，扩增产物在184 bp有条带时说明该位点为g，如果无扩增产物则为G。利用2对基因共同扩增待测DNA，即可检测G基因位点基因型。

2.3 分子标记检测的准确性

对甜瓜重组自交系群体的47个家系、3个F1及14个纯合品系进行分子标记的检测（表2）。No.3-2-2和WI846为雌雄异花同株，与3年的田间鉴定结果相吻合，而且基因型纯合。WI998为全雌系，TopMark为雄全同株，与3年的田间检测结果吻合，基因型纯合。3个杂交组合F1代，分子检测结果和田间观察结果相同，基因型为杂合型。

对研究材料开展田间表型鉴定，以单株开花雌花、雄花及完全花的比率确定性别类型，61份材料中，59份材料基因型和表现型结果相互吻合，WT7-2为全雌株（表2）。2013年田间检测为全雌株，2014年和2018年田间检测为雌雄异花同株；WT113基因型鉴定为雄全同株，2013年表型鉴定为雄全同株，2014年和2018年鉴定为雌雄异花同株；田间检测47个甜瓜重组自交系中19个家系为雌雄异花同株，4个家系为全雌株，24个家系雄全同株，1个家系株完全花株。分子标记选择效率为96.3%。结果表明，通过这两个分子标记能够分别鉴定基因纯合型和杂合型，并且能较为准确地鉴定甜瓜性别类型。

3 讨论

DNA分子标记辅助选择是通过利用与目标性状紧密连锁的DNA分子标记对目标进行间接的选择，基因克隆技术和分子生物技术的飞速发展，使目的性状的选择越来越准确。通过分子标记的早期选择可以克服隐性基因识别难度的问题，并且能够区别基因纯合型及杂合型，从而提高育种效率，加速育种进程［13-15］。通常情况下，分子标记辅助选择是根据QTL找到与其紧密连锁的分子标记，通过标记进行筛选，瓜类作物一些重要的性状主效QTL的已经被报道［5，16］，这些瓜类性状紧密连锁的标记可直接用于分子标记辅助选择。但是分子生物信息学研究发现，即使与性状连锁距离小于1 cm，在连锁区域包含很多候选基因，而基因间的互作可能影响对目标性状鉴定的准确性。因此，通过获得目的基因序列，设计引物，能够更加直接有效地鉴定目的性状。

图2 Cmhat与Cms标记检测G位点结果

表2 甜瓜重组自交系群体植株与验证植株性别表达田间鉴定

续表

甜瓜性别基因的研究始终绕着甜瓜性别表达、甜瓜性别基因定位展开，直到2008年甜瓜性别基因A基因和G基因的克隆才为甜瓜性别类型的选择提供了重要的理论依据［1-2］。本研究根据已经克隆的A基因和G基因，设计引物，目的在于不仅能够鉴定甜瓜性别，而且还能区分基因纯合型及杂合型，可以直接用于甜瓜育种工作。本研究表明分子标记能够成功地鉴定甜瓜性别类型，而且杂合基因型也能够准确地鉴定。本研究中WT7-2和WT113基因型鉴定分别为全雌株和雄全同株，由于甜瓜的性别表现受到环境因素等多方面的影响，而且部分雌雄异花同株植株在花芽类型的开放顺序也不尽相同（有的早期大量开放雌花，后期开放雄花；有的早期大量开放雄花，后期开雌花），可能是造成田间性状统计结果不同的原因之一。

此外，本研究种植每个家系12个单株，统计平均值作为田间调查的依据对研究结果也存在一定影响。WT113分子基因型鉴定为雄全同株，2013年田间鉴定结果与分子鉴定结果相同，但是2014年和2018年田间表现均为雌雄异花同株，除了受到环境条件的影响之外，花器官发育相关基因的表达差异也是影响甜瓜性别表达的因素之一［19］。研究者曾经对甜瓜不同性别转录组分析，挖掘甜瓜性别相关差异基因的研究中发现，花粉不育基因在雄全同株和雌雄异花同株中差异表达［20］，WT113田间性状的变化及与分子鉴定结果的不同，也可能是通过环境变化诱导差异基因表达，形成不同植株类型。