不同浓度131I-ELP近距离放射治疗兔VX2肝癌模型的实验研究

2019-05-09刘欣培王多伟申一鸣刘文天

世界华人消化杂志 2019年8期

关键词：放射治疗放射性B超

李茜,刘欣培,王多伟,申一鸣,贾强,刘文天

李茜,刘文天,天津医科大学总医院消化科天津市 300052

刘欣培,天津市第五中心医院消化科天津市 300450

王多伟,天津医科大学总医院普外科天津市 300052

申一鸣,贾强,天津医科大学总医院核医学科天津市 300052

核心提要：类弹性蛋白多肽(elastin-like peptide,ELP)作为一种新型生物医学材料,一直是近年来药物载体、药物控释研究领域的热点,本研究拟探讨其作为放射性核素131I的载体近距离放射治疗兔的VX2肝癌模型的有效性及不同放射性浓度131I-ELP疗效的差异性.

0 引言

世界上每年约有75万肝癌新发病例,其中一半发生在中国.原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,是社会和人民沉重的负担[1].肝癌的治疗方法主要有手术、放疗、化疗、局部射频消融和肝移植等,但其复发率高、预后差预示着现有治疗方法的局限性[2].放射性粒子植入是肝癌局部治疗的有效方法,其通过持续低剂量辐射,能最大程度杀伤肿瘤细胞[3].为使剩余正常肝组织能够得到再生,放疗野的设计便成为放射性粒子植入的关键,类弹性蛋白多肽(elastin-like peptide,ELP)因其可注射、可自组装、可降解及良好的的生物相容性[4,5],有望成为新型核素载体.本实验拟探讨ELP作为放射性核素131I的载体近距离放射治疗兔VX2肝癌模型的有效性及不同放射性浓度治疗效果的差异性.

1 材料和方法

1.1 材料 VX2荷瘤兔2只(南京市华兔生物有限公司);健康新西兰大白兔18只,雌雄各半,平均体质量3.5-4.5 kg,月龄3-4 mo(天津市奥臣实验动物销售有限公司);1%碘化钾口服液(天津医科大学总医院);Na -I131溶液(天津医科大学总医院);ELP由美国Duke大学生物医学工程系设计合成,分子量为50 kDa,其含有120个五肽(VPGXG)重复序列,相变温度为23.82 ℃,羧基端添加7个酪氨酸残基以便于同位素的标记[6];无菌实验台;兔解剖台;高压灭菌器;动物手术器械包;游标卡尺;ALOKA Prosound超声诊断仪;Discovery NM/CT 670单光子发射计算机断层扫描/计算机断层扫描(single-photon emission computed tomography/computed tomography,SPECT/CT);无菌纱布;无菌洞巾;注射器;采血针等,以上仪器由天津医科大学总医院提供.

1.2 方法

1.2.1 建立兔肝癌模型,检测治疗前的基线指标：采用直视下肿瘤组织小块包埋法建立兔VX2肝癌模型(图1),应用B超监测肝脏肿瘤的生长情况,将建模14 d经B超检查确认有肝癌生长的动物随机分为高放射浓度治疗(H)组(n=5),低放射浓度治疗(L)组(n=5)和空白对照(C)组(n=5),记录建模14 d后瘤体最长径(a)和最短径(b),按照体积计算公式(V=1/2×ab2)计算出肿瘤体积;经耳缘静脉采取兔外周静脉血,使用血液分析仪检测血常规,使用全自动生化分析仪检测兔丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST);于治疗前一周至治疗结束在动物饮用水中加入1%碘化钾,以防其甲状腺摄取放射性碘.

1.2.2 制备131I-ELP并检测其稳定性：依据造模后14 d B超量取的肿瘤体积,计算出所需131I-ELP的体积(40 μL/150 mm3)[6],计算公式为V药=V瘤/150×40,H组所需Na-I131=V药×100,L组所需Na-I131=V药×50,具体注射体积见(表1),采用iodogen法对ELP进行131I碘化标记并配置成放射性浓度为50 mCi/mL及100 mCi/mL溶液,置于冰浴中备用;使用同位素纸层析法分别于配置后0 h,24 h,48 h,72 h和96 h测定131I-ELP的放射化学纯度,以评估其体外稳定性.

1.2.3 放射治疗：实验兔麻醉(10%水合氯醛溶液,5 mL/kg腹腔注射),在B超引导下定位肝脏肿瘤,确定穿刺的部位、方向及深度,避开血管,分别将放射性浓度为50 mCi/mL、100 mCi/mL131I-ELP溶液及ELP溶液注入肿瘤内,停留60 s后拔针,使用纱布进行加压包扎,超声图像及治疗过程见(图2);H和L组动物注入药物后,利用SPECT/CT扫描观察放射性药物是否成功植入.

1.2.4 影像学监测：三组在治疗后7 d、14 d行B超检查,量取肿瘤最长径和最短径,得出肿瘤体积及肿瘤增长率;分别于治疗后7 d、14 d为H、L组行SPECT/CT检查放射性131I的组织分布.

1.2.5 检测肝功能及血常规数值：三组动物均于治疗后7 d和14 d在兔耳缘静脉取血,采用全自动生化分析仪检测ALT与AST水平,采用血液分析仪检测兔血常规.

图1 直视下肿瘤组织小块包埋法建立肝癌模型.

1.2.6 记录动物生存期：观察自肿瘤植入日起三组动物的自然生存时间.

1.2.7 病理组织学检查：动物自然死亡后进行尸检,离体观察肝脏肿瘤及其周围组织器官情况并进行组织病理学检查,观察是否出现腹腔内出血及腹膜炎等并发症.

统计学处理实验数据采用SPSS 23.0统计软件进行分析,计量资料以mean±SD表示,组间计量资料比较使用单因素方差分析;两组间比较采用SNK(Student-Newman-Keuls)q检验;P＜0.05时有统计学意义.

2 结果

2.1 标记物体外稳定性131I-ELP在冰浴条件中存放96 h,其放化纯度仍能维持在97.3%.

2.2 治疗前基线指标 H组、L组和C组治疗前(VX2肝癌建模后第14天)的肿瘤体积、肝功能(ALT、AST)和血常规(Hb、RBC)等基线指标无显著差异(表2和3).

2.3131I在体内的分布治疗后7 d、14 d的SPECT/CT结果示治疗组的放射性持续位于肿瘤内部,未见其它放射性摄取组织(图3).

2.4 肿瘤生长变化随着时间的推移,治疗后三组肿瘤体积较治疗前均出现进行性增加(图4A和B),H组肿瘤生长率(tumor growth rate,TGR)最小,C组TGR最大,三组比较有显著性差异(P＜0.05).

2.5 生化检查随着时间的推移,治疗后H和L组动物的血清ALT、AST出现了先升高后降低的变化,C组ALT、AST数值则持续上升(图5).治疗后7 d L组动物ALT数值最低,C组ALT数值最高,三组差异有统计学意义(P＜0.05),C组AST数值显著高于H和L组(P＜0.05),但H和L组的AST数值无显著差异;治疗后14 d C组ALT数值显著高于H和L组(P＜0.05),而H组和L组的ALT水平无显著差异,L组动物AST数值最低,C组AST数值最高,三组差异具有统计学意义(P＜0.05).三组动物Hb、RBC计数无显著差异(表4).

2.6 动物自然生存期分析自然生存时间(自肿瘤种植之日算起,图6)发现,H组为61.4 d±10.50 d,L组为52.6±8.85 d,C组为39.2 d±5.63 d,三组动物的生存期相比较有统计学差异(P＜0.05).

As the understanding of myocardial protection improved,the use of mildly hypertrophic left ventricles with short ischaemic times were also proposed with the caveat that there were no ECG changes[116].

2.7 尸体解剖动物死亡后尸检发现,H组动物未见有腹膜炎和腹腔积液等并发症,L组一只(20%)出现腹膜炎,C组一只(20%)出现腹腔积液、一只(20%)出现肺转移.VX2肝癌与正常组织边界清晰,瘤体呈圆形或椭圆形,质硬,切面中心可见黄白色干酪样坏死物(图7).

2.8 病理组织学检查 H组可见肿瘤周围肝细胞变性坏死,汇管区小胆管扩张,肝窦及汇管区可见胶原纤维沉积,肝内出现条索状纤维增生,肿瘤组织内部见大片状坏死(图8A).L组仅有少量纤维增生,肿瘤组织内部见大片状坏死(图8B).C组肿瘤组织被膜处可见明显纤维组织增生,肿瘤组织内可见小片状坏死(图8C).

3 讨论

肝癌是世界上癌症相关死亡的第二大原因,过去二十年来,与肝癌相关的年死亡率显著增加,其中大多数来自亚太地区[7].因肝癌起病隐匿,早期症状不典型,有超过70%的肝癌患者发现即为中、晚期,失去了手术切除的机会[2],这严重影响了肝癌患者的总体预后.因此,肝癌的非手术治疗显得尤为重要.近距离放射治疗不受肿瘤位置和大小影响,适用于大多数的肝癌患者[8],其植入的放射性粒子能够精准、持续地发出射线,从而杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤的生长.131I因其可在短距离衰减并在目标部位保持较高的累计计量,且能减少邻近正常组织损害等优点被广泛应用于肿瘤的治疗[9].有研究发现,与单独应用射频消融术相比,联合应用放射性125I可显著降低小肝癌的复发率并延长其生存期[10].ELP是一种新型生物医学材料,因其可逆温敏相变性、良好的组织相容性、可降解性等优点,一直是近年来药物载体、药物控释研究领域的热点[11,12].我们的前期研究发现,应用ELP作为一种内镜黏膜下剥离术的黏膜注射液,可持久地维持黏膜厚度并减少出血量,有利于黏膜的剥离和切除[13].凝胶状的ELP在体内可以存留7 d以上,131I的有效半衰期为3.5-5 d,一般4个半衰期后放射性残留基本消失,根据SPECT/CT显示,治疗14 d后131I仍持续位于肿瘤内.ELP这一特性大大减少了放射性物质的迁移,从而更精准地杀伤肿瘤细胞.使用131I-ELP对人前列腺癌裸鼠移植癌进行近距离放射治疗,发现植入一周后131I-ELP的瘤内保存率高达85%,131I-ELP能有效延缓肿瘤生长及延长裸鼠的生存时间[6].动物实验发现,以ELP为载体携带131I对兔VX2肝癌进行放射性治疗可显著抑制肿瘤生长并改善肝功能[14].本次研究在B超引导下将放射性131I-ELP直接注入动物的肝肿瘤内,不经血液循环代谢,提高了131I在肿瘤局部的治疗效果.分析实验中的TGR结果发现,与C组相比,100 mCi/mL、50 mCi/mL两种放射性浓度的131I-ELP均可抑制肿瘤生长,且放射性浓度较高的H组的肿瘤抑制效果更强.分析治疗前后血中AST、ALT水平的变化,发现在治疗后7 d,H、L组的AST、ALT水平升高而后在治疗后14 d下降,原因可能为131I的有效半衰期为3.5-5 d,放射性核素的第一个半衰期杀伤作用最强,使癌旁正常肝细胞变性坏死,因此,ALT、AST出现短暂上升,随着放射性核素的衰减,ALT、AST水平逐渐下降,因此,我们认为131I-ELP可改善肝功能的恶化,其中放射性浓度为50 mCi/mL的L组的治疗效果更佳,镜下观察病理组织切片发现,H组的癌旁正常肝组织破坏较L组严重,分析原因可能为100 mCi/mL的H组对癌旁正常组织的损伤更大.分析治疗前后血Hb、RBC含量发现,131I-ELP无骨髓抑制等副作用.比较实验动物生存期可见,131I-ELP放射性治疗可延长肝癌动物的生存时间,且放射性浓度越高,生存期越长.

图2 瘤内注射131I-类弹性蛋白多肽的过程.A：B超显示穿刺针已刺入肿瘤内部;B：向瘤内注射药物的操作.

图3 高放射性浓度治疗组和低放射性浓度治疗组治疗后的SPECT/CT图像.A：治疗后7 d的SPECT/CT 图像;B：治疗14 d后的SPECT/CT图像.H组：高放射性浓度治疗组;L组：低放射性浓度治疗组.

图4 三组动物治疗后7 d(A)、14 d(B)的肿瘤增长率.TGR：肿瘤增长率;H组：高放射性浓度治疗组;L组：低放射性浓度治疗组;C组：对照组.aP＜0.05,与H组比较;cP＜0.05,与L组比较.

图5 三组治疗后7 d、14 d的ALT与AST水平.A：治疗后7 d ALT水平;B：治疗后14 d ALT水平;C：治疗后7 d AST水平;D：治疗后14 d AST水平.AST：天门冬氨酸氨基转移酶;ALT：丙氨酸氨基转移酶;H组：高放射性浓度治疗组;L组：低放射性浓度治疗组;C组：对照组.aP＜0.05,与H组比较;cP＜0.05,与L组比较.

图6 三组动物的自然生存时间.H组：高放射性浓度治疗组;L组：低放射性浓度治疗组;C组：对照组.aP＜0.05,与H组比较;cP＜0.05,与L组比较.

图7 肝脏肿瘤大体标本.

表1 药物注射体积和131I的放射性活度

图8 三组肝脏肿瘤HE染色结果.A：高放射性浓度治疗组;B：低放射性浓度治疗组;C：对照组.

总之,131I-ELP可抑制肝癌细胞的生长、延缓肝功能的恶化、延长动物生存时间且无骨髓抑制等副作用,说明131I-ELP近距离放射疗法对兔VX2肝癌具有肯定的疗效;其中放射性浓度为100 mCi/mL的131I-ELP抑癌效果更强,但也对癌旁正常肝组织造成了更大的伤害.因此,还需进一步实验以优化放疗药物的浓度或增加治疗频率,使131I-ELP对肝癌的近距离放射疗法的安全性和有效性达到平衡,令患者获得最大的收益.