米诺环素对大鼠闭合性脊髓损伤的神经保护作用

黄雄伟业，张绍东，历俊华，王彬彬，冯洁，刘松，万虹

首都医科大学，北京市神经外科研究所，北京市100070

急性脊髓损伤多由车祸、高空坠落等原因造成，导致患者长期瘫痪，给家庭和社会带来巨大经济负担和社会负担[1-2]。脊髓损伤由外伤引起脊髓横断或压迫引起，可分为原发性损伤与继发性损伤：原发性脊髓损伤是外力直接或间接作用于脊髓所造成的损伤；继发性脊髓损伤是指在脊髓损伤后2~48 h发生的损伤，主要病理变化之一是离子失调和兴奋性毒性物质释放。离子失调，特别是钙离子浓度失调，可引发钙蛋白酶活化、线粒体功能障碍和自由基生成，导致细胞坏死和凋亡[3-4]。减轻继发性损伤、防止其进一步恶化，对脊髓损伤后功能恢复非常重要[5]。

氯化镁中的镁离子为钙离子的生理拮抗剂[6]，能减弱钙超载所造成的细胞损伤，是公认的神经保护剂，广泛应用于产前对胎儿神经系统的保护[7]。

米诺环素化学名为二甲胺四环素，是第二代半合成四环素类药物的衍生物，具有相对分子质量小、亲脂性高、可通过血-脑屏障、口服易吸收的特点，作为抗生素可用于治疗牙周炎、痤疮等疾病[8-10]。长期口服米诺环素无明显不良反应，安全性好[11]。米诺环素对神经系统有保护作用，可缩小损伤范围，减轻轴突变性，加快运动功能恢复[12]。本研究探讨米诺环素在急性脊髓损伤中，对继发性损伤的神经保护作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

健康SPF雄性Sprague-Dawley大鼠24只，体质量(190±20)g，由北京维通利华实验动物有限公司提供，实验动物许可证号SCXK(京)2016-0011。适应性饲养2 d，室温20~25℃，室内光照，控制进食和水。

实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准，并得到北京市神经外科研究所动物伦理委员会的批准，审批文号201703004。

1.2 主要试剂与仪器设备

米诺环素、氯化镁、聚乙二醇：英国ABCAM公司。苯巴比妥：法国CEVA公司。120602F压迫水囊：FORGATY公司。Luxol Fast Blue(LFB)染色试剂盒：北京雷根生物技术有限公司。M400-E显微外科手术显微镜：德国徕卡公司。Neuro-MEP-micr2电生理仪：俄罗斯NEUROSOFT公司。微量注射泵：北京普天益人医疗科技有限公司。T7.0动物磁共振仪：德国BRUKER公司。

1.3 模型制备

水囊接三通，三通一端接改进的胰岛素注射器，另一端接大气。管内注入生理盐水，排除气泡，注入生理盐水35 μl，观察球囊膨大正常，抽出生理盐水。

大鼠予苯巴比妥1 ml/kg腹腔注射麻醉，俯卧，剃除背部毛发，确认棘突最高位置为T10；背正中切口，暴露T13棘突和椎板，切除棘突，在T12-13间小心去除椎板；从T12后缘与脊髓平行向头侧插入水囊18 mm，注入盐水35 μl；30 s后打开三通，抽出水囊。分层缝合肌肉、筋膜和皮肤，置于温箱中。大鼠苏醒后单独饲养2 d，然后合笼饲养。人工按摩腹部，直至恢复自主排尿、排便。

造模成功标准：观察双侧下肢完全瘫痪，并立即行动物磁共振检查，影像学判定脊髓压迫部位及损伤大小。剔除不成功者，并予补足。

1.4 动物分组及给药

大鼠造模前颈外静脉置管。苯巴比妥1 ml/kg腹腔注射麻醉，颈部及相邻背侧备皮。大鼠仰卧，颈中线右侧切口1 cm，暴露、分离颈外静脉，置入自制留置输液装置，含有肝素的生理盐水稀释液封管。

造模成功的大鼠随机分为盐水组(n=8)、氯化镁组(n=8)和米诺环素组(n=8)。分别称取93.75 mg(剂量 1)、68.75 mg(剂量 2)、25 mg(剂量 3)米诺环素粉末，溶于生理盐水10 ml中，震荡溶解。米诺环素组术后第1天予剂量1，第2天予剂量2，第3~7天每天予剂量3，每天13:00静脉注射。氯化镁组和盐水组术后当天7:00、15:00、23:00各注射相应药物1次，直至术后第7天。

所有大鼠均以2 ml/kg、0.05 ml/min通过静脉留置管给药。

1.5 Basso-Beattie-Bresnahan评分(BBB评分)

术后当天开始，前两周每两天进行一次BBB评分[13]，之后每周两次BBB评分，持续到术后第31天。大鼠置空旷平地上自由活动，评分前适应性活动3 min，观察活动3 min进行评分。分别对左右腿进行评分，取均值。

1.6 运动诱发电位检测

完成BBB评分后，各组5只大鼠10%水合氯醛1 ml/kg腹腔注射麻醉，背部胸腹段及大腿备皮，俯卧位置于鼠板上，刺激电极置入硬脑膜外侧，接收电极置于腓肠肌，地线插入背部皮内，单次电信号刺激，1 Hz、0.1 ms方波，强度25~30 mA，接收电极记录振幅，至少3次以上重复性好时，记录保存。

1.7 感觉诱发电位检测

各组取4只大鼠，麻醉及皮肤处理同上。切开背部皮肤，暴露棘突，找到损伤的椎骨，去除椎板，暴露T9脊髓，将接收电极从背侧椎间隙插入到脊髓和椎骨间，明胶海绵固定。分离坐骨神经，将刺激电极插入坐骨神经主干，地线插入背部皮内，重复电信号刺激，1 Hz、0.2 ms方波，强度4.5 mA，叠加50~100次，接收电极记录振幅，至少3次以上重复性好时，记录保存。

1.8 LFB染色

电生理检测后，各组取3只大鼠4%多聚甲醛心脏灌注固定处死，取T9-11脊髓，4%多聚甲醛中后固定，脱水、浸蜡、包埋，切片，厚4 μm。常规脱蜡、入水，置95%乙醇中，加LFB染色液，室温20 h。95%乙醇洗去多余染色液，蒸馏水冲洗，入Luxol液分色15 s，入70%乙醇分色30 s至灰白质清晰；蒸馏水冲洗，伊红复染，常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。ImageScope软件扫描损伤面积最大、两端含有正常脊髓结构的切片，Image J软件通过阳性区域阈值圈定范围方式计算染色阳性区域面积。

1.9 统计学分析

采用GraphPad Prism 6.0软件进行数据分析。所有数据均用(xˉ±s)表示，组间比较采用单因素方差分析。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 磁共振检查

选造模术后双下肢完全瘫痪、BBB评分为0的大鼠行磁共振检查。冠状位和水平位可见T2低信号，脊髓组织受压、萎缩，周围水肿(图1)。

2.2 BBB评分

三组BBB评分均随时间的推移逐渐增高。术后第2~14天组间无显著性差异(P>0.05)；术后第17~31天米诺环素组高于盐水组(P<0.05)，氯化镁组与盐水组和米诺环素组之间均无显著性差异(P>0.05)。见表1。

2.3 运动诱发电位

米诺环素组运动诱发电位振幅高于盐水组(P<0.05)，氯化镁组与盐水组和米诺环素组之间均无显著性差异(P>0.05)。见图2、表2。

图1 磁共振T2加权像

表1 各组大鼠BBB评分比较

2.4 感觉诱发电位

各组间感觉诱发电位振幅无显著性差异(P>0.05)。见图3、表3。

2.5 LFB染色

米诺环素组损伤面积低于盐水组(P<0.05)，氯化镁组与盐水组和米诺环素组之间均无显著性差异(P>0.05)。见图4、表4。

表2 各组运动诱发电位比较(μV)

表3 各组感觉诱发电位比较(μV)

表4 各组损伤面积比较比较(mm2)

图2 各组运动诱发电位波形图

图3 各组感觉诱发电位波形图

图4 各组损伤区域面积(LFB染色,bar=500 μm)

3 讨论

目前有多种制备脊髓损伤动物模型的方法，如重物坠落法脊髓挫伤模型、脊髓半横断或全横断损伤模型、牵拉性脊髓损伤模型等[14-16]，这些动物模型都为开放性脊髓损伤，需手术去除椎骨和椎板，完全暴露脊髓，这种损伤方式临床不可能发生。为了模拟临床上常见的闭合性脊髓急性损伤[17]，我们开发球囊压迫大鼠脊髓背侧急性损伤动物模型。此模型下，脊髓损伤面积和治疗空间保持稳定，有利于病理生理变化的观察。我们还研发了一种实验动物用静脉留置输液装置，现已申报发明专利。

电生理是一种用于评价神经传导功能的检测手段，振幅越高，神经传导功能越好[18-19]。本研究显示，运动诱发电位振幅盐水组最低，米诺环素组最高，氯化镁组介于两者之间，与BBB评分结果相似。说明脊髓损伤后运动功能的恢复与运动诱发电位检测结果相符。而感觉诱发电位振幅各组间无显著性差异，可能由于米诺环素主要作用于中枢神经系统，末梢感受器中浓度不高，作用不明显。有待进一步研究。

米诺环素具有能穿过血脑屏障、口服易吸收以及神经保护作用的特点，被用于诸多神经系统性疾病的治疗研究中[20]。Wells等[21]首次报道，米诺环素对急性开放性脊髓损伤有保护作用，可缩小脊髓损伤范围，减轻轴突变性，加快运动功能恢复。Teng等[22-23]报道，米诺环素对急性挫裂性脊髓损伤有治疗作用，不仅可通过减少线粒体细胞色素C的释放而减少细胞凋亡，还可加速大鼠神经功能恢复。Aras等[24]发现，米诺环素对大鼠开放性脊髓损伤的保护作用与其抗氧化激活机制有关。

由于米诺环素具有良好的脂溶性和能够穿过血脑屏障，我们选择缓慢持续静脉给药方式，使药物在中枢神经系统中保持稳定的血药浓度；由于米诺环素代谢排出率较低，大部分在体内滞留，因此采用不同药物浓度阶梯给药，后续仅需维持血药浓度即可。这种给药方式符合药理学规律，也贴合临床实际。

目前人们分别从神经功能恢复、电生理检测以及抗凋亡等方面，证明米诺环素对脊髓急性损伤具有保护作用[24-25]。本研究显示，米诺环素和氯化镁一样，在脊髓急性损伤后可促进神经功能恢复，增强神经传导，减少继发性损伤面积。为今后临床药物开发奠定基础。