早期帕金森病患者脑脊液生物标志物及炎症因子水平的研究

杨凌飞 刘爱华 耿一萌 项 志 滕军放△

郑州大学第一附属医院 1)神经内科 2)肿瘤科，河南 郑州 450052

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是临床中常见的神经系统退行性疾病，呈进展性病程。流行病学研究显示，帕金森病患者的平均发病年龄约为60岁，男性略多于女性[1]，临床表现包括运动及非运动症状[2-3]。运动症状主要表现为运动迟缓、强直、震颤和行走不稳，与黑质纹状体系统多巴胺能神经元的变性缺失及α-突触核蛋白异常沉积形成的路易小体有关[4-5]。目前，尚无特异敏感的生化指标可作为早期帕金森病临床诊断的依据。该领域的研究主要集中在脑脊液神经元蛋白(α-syn、总Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白)水平上，但结论尚未统一[6-9]。本研究旨在评估早期帕金森病患者脑脊液中生物标志物及炎症因子水平及其相对比例在临床早期阶段的诊断价值。

1 资料与方法

1．1一般资料2016-09—2018-05收集郑州大学第一附属医院神经内科门诊及住院早期PD患者及健康对照者，52例早期帕金森病患者(Hoehn-Yahr 1～2.5级为早期)，35例健康对照组，共87例自愿参与本研究，均由两位神经内科运动障碍方面专家共同诊治，符合国际帕金森病和运动障碍协会(MDS)2015年帕金森病的临床诊断标准[10]。2组纳入标准：(1)愿意配合进行UPDRS评分、H-Y分级等测试，接受腰穿脑脊液检查者，并签署知情同意书；(2)可使用普通话沟通交流；(3)年龄50～80岁。健康对照组需满足没有任何神经及精神系统疾病。2组排除标准：(1)患有肿瘤和其他躯体严重疾病者，无法完成UPDRS评分等测试、腰穿脑脊液检查；(2)3个月内服用左旋多巴及其他可能影响认知功能药物者；(3)既往有脑炎、脑血管病、服用抗凝或抗精神病药、重金属中毒、脑积水等病史。本研究获得了所有受试者的知情同意。

1．2方法

1．2．1 调查方法：①一般信息调查：收集姓名、性别、年龄等一般信息资料。②PD疾病情况调查：收集PD受试者病程、运动及非运动症状及左旋多巴的服用情况，进行帕金森综合评分量表(unified parkinson’s disease rating scale，UPDRS) I-IV评分，评估运动障碍、日常生活行为、运动体征及运动并发症情况，结合改良Hoehn-Yahr分级量表(H-Y分级)、简易智能状态检查量表(Mini mental state examination，MMSE)、蒙特利尔认知评估量表(Montreal cognitive assessment，MoCA)辅助医生进行临床诊断。

1．2．2 脑脊液检查：收取患者脑脊液样品，取2～3 mL脑脊液用于炎症因子(TNF-α、CRP、IL-8)检测，另取8～10 mL脑脊液收集在聚丙烯管中，并在提取10 min内以2 000 g离心10 min，随后将上清液储存于-80℃。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒测定脑脊液中T-Tau、P-Tau和α-syn蛋白含量，通过单纯分析蛋白浓度获得各蛋白比例，使用T-Tau、α-syn蛋白作为分母来计算组合比率。1周后，嘱受试者于相同时间段接受脑脊液炎症因子检测，取2次炎症因子的平均值进行统计分析。

1．3统计学方法采用统计软件SPSS 21.0进行数据分析。对所有样本变量采用双样本t检验。使用接受者操作特征曲线(ROC)分析确定诊断准确性，并运用曲线下面积(AUC)量化评估诊断的总体水平(AUC越接近1，总体诊断性能越好)[11]，P<0.05为差异有统计学意义，检验水平α=0.05，并选择双侧检验。

2 结果

2．1PD受试组及健康对照组一般情况52例早期帕金森病受试患者中，因无法配合腰椎穿刺术排除4例(女，63、64、71岁；男，78岁)，因无法配合临床检查或量表评分排除1例(女，69岁)，其余47例早期帕金森病患者满足纳入标准。早期PD受试者UPDRS评分、MMSE评分显著高于健康对照者(P<0.001)，PD受试者UPDRS评分、H-Y评分、MMSE评分、MoCA评分情况见表1。

2．2脑脊液生物标志物及炎症因子水平比较比较PD组与对照组脑脊液生物标志物水平，PD组脑脊液中α-syn蛋白水平低于对照组(P=0.007)，PD患者脑脊液CRP、IL-8、总体Tau蛋白及磷酸化的Tau蛋白水平较对照组有所升高，其中CRP(P=0.009)、IL-8水平差异有统计学意义(P<0.001)。以脑脊液中总体Tau蛋白浓度、α-syn蛋白浓度作为分母，以脑脊液中总体Tau蛋白、磷酸化的Tau蛋白作为分子，对比PD组与对照组后发现，PD组脑脊液T-Tau/α-syn及P-Tau/α-syn比例较对照组显著升高(P<0.001)，PD组脑脊液P-Tau/T-Tau比例较对照组未出现显著性差异。见表2。

表1 2组一般情况比较

2．3脑脊液临床诊断价值运用ROC分析比较PD组与对照组生物学标志物的敏感性及特异性，脑脊液CRP水平具有较低的诊断价值(AUC=0.619；敏感性=58.8%；特异性=63.4%)，而α-syn(AUC=0.804；敏感性=77.2%；特异性=72.9%)、IL-8(AUC=0.848；敏感性=69.6%；特异性=90.4%)和P-Tau/α-syn比例(AUC=0.890；敏感性=86.8%；特异性=80.3%)具有较高的诊断价值。由于脑脊液IL-8水平在2次脑脊液检测结果中变异性较大，选取CRP水平与P-Tau/α-syn比例组合作为鉴别诊断的指标，结果表现出更高的临床诊断价值(AUC=0.931，敏感性=92.1%，特异性=78.0%)。见表3。

为评估帕金森病患者脑脊液生物标志物及炎症因子与简易智能状态检查量表(MMSE)评分的相关性，运用Pearson相关性分析对PD患者脑脊液α-syn，总Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白、炎症因子(TNF-α、CRP、IL-8)及MMSE评分进行相关性分析，结果显示，C反应蛋白、白介素IL-8、磷酸化Tau蛋白水平与MMSE评分间存在显著相关性，其中，C反应蛋白水平与MMSE评分存在较强负相关性。见表4。

3 讨论

本研究旨在评估帕金森病患者脑脊液生物标志物(α-突触核蛋白、总Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白)及炎症因子(CRP、IL-8、TNF-α)水平及其相对比例在临床早期的诊断价值。α-突触核蛋白和Tau蛋白是脑内含量丰富的神经蛋白，既维持正常的突触功能，又与神经退行性疾病密切相关，研究显示，血浆Aβ、α-syn、T-Tau、P-Tau蛋白浓度变化与帕金森病的发病机制及运动障碍密切相关[12-13]。另有临床研究表明，炎症因子(CRP、IL-8、TNF-α)参与的免疫源性氧化应激是导致黑质纹状体途径神经元变性的原因之一[14-15]，其在血浆、脑脊液的改变趋势得到广泛研究，但由于疾病严重程度、个体变异性、样品处理方法、分析方法的差异，结果存在较大分歧[16-18]。

据相关研究报道，PD患者脑脊液α-突触核蛋白水平较正常者具有一定程度上的降低[19-20]，但将其作为鉴别早期PD患者的诊断依据尚不具有说服力[19]。关于PD患者脑脊液α-突触核蛋白减少的机制有以下几种观点：α-突触核蛋白主要在神经元内沉积，而不是积聚在细胞外空间中；α-突触核蛋白的沉积导致神经元分泌功能活性降低；由于α-突触核蛋白的播散导致正常神经元中编码α-突触核蛋白的基因(SNCA)表达量减少，并使α-突触核蛋白胞吐作用的下降[21]。本研究验证了临床早期PD患者脑脊液α-突触核蛋白水平较正常者显著降低，为其用于辅助诊断临床早期PD患者提供了新的支持。

表2 2组脑脊液生物标志物及炎症因子值比较

注：TNF-α、CRP、IL-8值为2次脑脊液检测的平均值，*P<0.05

表3 脑脊液生物标志物及炎症因子在临床诊断和鉴别诊断中的价值评估

注：*表示P-Tau /α-syn蛋白比例与CRP水平组合

表4 帕金森病患者脑脊液生物标志物及炎症因子与简易智能状态检查量表(MMSE)评分的相关性

注：N为样本量，Pearson correlations为相关系数，*为相关性具有统计学差异

同时，PD患者脑脊液中Tau蛋白同种型(磷酸化的Tau蛋白)与α-突触核蛋白两者比例与对照组比较发现，PD患者脑脊液T-Tau/α-syn及P-Tau /α-syn蛋白比例显著升高。一方面，Tau蛋白是神经系统中含量最高的微管相关蛋白，其在调节神经细胞生长发育过程中起关键作用，并参与神经元轴突通讯传导过程。在神经退行性疾病(如阿尔茨海默病)中，过度磷酸化的Tau蛋白聚集形成神经纤维缠结参与氧化自由基系统的启动，后者可导致神经细胞的死亡。另一方面，Lewy小体作为PD患者重要的病理改变，其主要由α-突触核蛋白组成，但同时含有少量Tau蛋白，因此，相关研究显示，Tau蛋白的异构与α-突触核蛋白的异常沉积连锁导致帕金森病的病程进展[22]。这一理论也得到Tau蛋白病如进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)和突触核蛋白病如PD的病理征重叠的支持[23-25]。本研究通过分析样本数据得出，临床早期PD患者脑脊液中总体Tau蛋白水平与对照组无明显差异，而磷酸化Tau蛋白水平较对照组升高，这提示临床早期PD患者中总体Tau蛋白水平未出现明显改变，但Tau蛋白的功能性及结构性已经被破坏。

最新Meta分析显示，炎症因子在PD与健康对照组之间存在显著差异[9]，提示PD的发病机制可能伴随机体炎症反应的失调。本文证实早期PD患者脑脊液C反应蛋白及IL-8水平显著升高，但IL-8水平在2次脑脊液检测中变异性较大，提示脑脊液C反应蛋白值有成为炎症生物标志物的潜能。将相对稳定的C反应蛋白值与PD相关生物标志物(α-突触核蛋白、Tau蛋白)水平结合，可进一步增加对诊断临床早期PD患者的诊断价值。

本研究发现，帕金森病患者脑脊液中生物标志物及炎症因子水平与认知障碍程度相关，并通过Pearson相关分析帕金森病患者脑脊液中炎症因子(TNF-α、CRP、IL-8)及α-syn，总Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白水平与MMSE评分的相关性证实了该观点，但是否与帕金森病的发病机制相关尚待进一步研究。有研究表明，C反应蛋白是肝脏合成的一种炎症诱导物质，其对内皮细胞、内皮母细胞、白细胞和血小板都发挥强大的促炎作用，并可能放大炎症反应[26-30]。在长期队列研究中，帕金森病患者血清炎症因子水平，如TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-10水平的升高与认知障碍程度MMSE评分的降低之间存在显著相关性，以此反映外周免疫反应的促炎/抗炎因子平衡破坏与帕金森病认知障碍程度存在关联性[31-33]，但一直缺乏中枢神经系统促炎/抗炎因子平衡紊乱的直接证据，本文通过研究C-反应蛋白等炎症因子与帕金森病认知障碍程度的相关性分析，为中枢神经系统促炎/抗炎因子平衡紊乱及其与认知障碍程度的关联提供数据支持，对临床预测帕金森病患者认知障碍预后程度提供了新的思路。

本研究通过ELISA检测对相关蛋白进行定量检测，结果显示早期帕金森病患者脑脊液α-syn蛋白水平显著降低，CRP、IL-8水平及T-Tau/α-syn、P-Tau/α-syn比例显著升高，提示脑脊液α-syn，CRP水平及T-Tau/α-syn、P-Tau/α-syn比例可能具有帕金森病生物标志物的潜能，其中C反应蛋白与磷酸化的Tau蛋白/α-突触核蛋白比例组合可更准确的协助临床早期诊断，提示。此外，早期PD患者脑脊液总体Tau蛋白及磷酸化的Tau蛋白浓度呈现小幅度升高，尚无统计学差异，但随着更大规模的临床研究开展，其变化趋势及应用潜能可获得进一步探讨。