基于高倍物镜的相位显微成像方法∗

杨 颖 张 岩

(首都师范大学物理系,北京 100048)

0 引 言

显微成像技术在光学测量领域中有着广泛的应用.传统的成像器件只对强度敏感,采集的图像中只包含振幅信息,忽略了相位信息.对于相位型样品,相位信息通常包含更多的细节特征.通过相位信息的测量,可以观测到传统方式无法检测到的信息.在一些特定的应用领域,如显微成像[1-2]、图像加密解密[3-4]、精密元件检测[5]、生物医学研究[6]等具有重要的意义.

目前在显微成像领域大多采用干涉方法.干涉方法主要通过记录、解析物光与参考光的干涉信息,得到样品的相位信息.激光技术及电耦合元件CCD(charge coupled device)的相继发明,促进了数字全息等基于干涉方法的相位成像技术发展,很快应用于相位显微成像领域[7].随着技术及硬件的不断发展,新兴的干涉技术已经实现了细胞级别的相位显微成像.2007年Choi 等[8]利用层析相位显微术技术定量测定活体组织中三维折射率的分布情况,并展示了细胞结构随时间的演变情况.2017年,Chowdhury 等[9]提出了一种基于结构照明的显微成像方法,通过标准衍射层析计算,重建乳腺细胞三维折射率分布.这些基于干涉技术的相位成像方法,相位测量结果精度很高,然而对参考光有较强依赖,测量光路复杂光学器件成本高昂.迄今为止,如何实现既简单又高效的相位显微成像仍然是一个挑战.

相位恢复方法作为一种非干涉相位测量技术,克服了干涉法的弊端,无需参考光束,光路简单.相位恢复方法直接测量强度分布,经反复迭代计算得出相位信息.Gerchberg-Saxton(GS)算法开创了双强度面迭代相位恢复方法的先河[10].杨顾算法是继GS 算法后又一经典迭代类相位恢复算法,扩大了GS 算法的适用范围[11].这两种迭代类型的经典相位恢复算法,计算过程依赖于初始采集的两个或单个强度面数据进行反复迭代.如果这两个强度面给予的已知信息不够充分,容易导致计算陷入局部极小停滞.并且这两个面的测量数据伴随整个迭代过程,如果初始采集存在实验误差,会制约重建结果的精度.因此继GS 算法和杨顾算法之后,一些研究提出了多强度面重构完整波场的方法[12].这种方法增加了测量面的个数.每增加一个测量面的数据都增加了计算时的已知信息,可以迅速高精度地逼近重建目标,从而可以不经迭代[13]或仅迭代有限的次数[14],即可得到良好的重建结果.相位恢复方法广泛用于相位测量、图像处理和图像加密.然而,相位恢复方法在显微成像领域应用尚且不多.

本文将相位恢复方法与显微成像相结合,通过光场强度测量,由相位恢复算法重构物体相位信息.显微系统采用高倍大数值孔径物镜,提出了一种同步移动CCD 和显微物镜的拍摄方式,改变了传统相位恢复方法单纯移动CCD 位置的拍摄方法.解决了高数值孔径物镜的焦距值小,传播面间采样距离无法满足成像关系的问题.本文所提出的显微方法,重建过程无需迭代处理.与其它相位显微方法相比,它具有非干涉、无迭代,实验结构不复杂,成本低,操作方便等优点.可以应用于微米量级尺寸样品的三维相位显微成像研究.

1 高倍物镜显微成像原理

本文用普通光学高倍显微物镜构建显微系统,实现相位显微成像.用显微系统拍摄样品成像最清晰位置及两个不同传播距离的放大强度像,利用相位恢复算法重建物体的相位信息.采样定理对传播面的间隔距离有要求,如果间隔距离小于采样要求,则可能无法恢复相位[15].

1.1 采样定理及成像关系对传播面间距的要求

基于高倍物镜的显微系统,实现相位显微成像的关键是如何保证各物面位置满足成像关系的同时,使它们之间距离满足采样公式的要求.显微系统的成像关系与凸透镜的成像规律一致.如果CCD能采集到放大实像,样品所在平面(O0)及其衍射物面O1、O2应位于显微系统2 倍焦距与焦距之间(图1)[16].且3个采样面间的距离应满足采样条件的要求.传统的拍摄方法是移动CCD 位置采集O0、O1、O2的衍射放大像,以便进行相位重建.高倍物镜数值孔径较大焦距较短,物距(W0)大小与焦距(f)非常接近,二者差值应满足采样公式要求,以便能容纳3个衍射物面.根据采样关系,当入射波长(λ)一定时,相邻衍射面间传播距离(z)的取值,与衍射面像素数M、N以及采样面上的采样间隔Δx、Δξ相关,如图2所示.z需至少满足采样公式的最低距离要求才能恢复相位[15].

图1 显微成像关系示意图

图2 采样关系示意图

如果λ=632.8 nm,相邻衍射物面间像素大小Δξ=Δx=0.1 μm,像素数目(N)=512,那么z至少需大于29 μm.本文使用高倍物镜(100 ×,数值孔径(NA)=0.9)搭建显微系统,f=2.149 8 mm,虽然理论上2 倍焦距与f之间的距离足够容纳多个衍射物面,但是由于高倍物镜焦距很小,且物镜镜头表面在物镜套筒内,实验中不容易测量物距,因而很难控制这一距离.2.2 节的实验中,由物像变换关系实际得到物距w0=2.178 6 mm,算得样品与焦距间的距离为29.1 μm.显微成像关系要求物面位于系统2 倍焦距与焦距之间,若第一个衍射物面O1与样品O0间的距离满足了采样公式要求,则第二个物面O2的位置不会处于样品O0与焦距之间,而是位于焦距与透镜之间,对应像面为虚像,因此导致无法恢复相位.

1.2 同时移动显微物镜与CCD的拍摄方法

为了使衍射物面间距既能满足菲涅尔近似又能满足采样定理及成像位置的要求,本文提出一种固定像距,同步移动显微物镜及CCD 的拍摄方式,可以更方便地满足上述采样距离的要求.拍摄方法如图3所示.

显微系统的入射光源为相干平面波,照射样品后,样品的衍射花样经显微系统放大,由CCD 相机记录物体放大衍射图样.O0面为样品所在平面,首先用CCD 记录其成像最清晰平面I0的强度信息.像面与显微物镜间的距离(Z)为像距,对应物面到显微物镜的距离(W)为物距.保持Z不变,将显微物镜与CCD 沿光场传播方向同步向后移动Δd距离,采集第一个衍射物面O1的放大像面信息.拍摄完毕后,再次将显微物镜与 CCD 同步向后移动 Δd距离,记录样品的第二个衍射面O2面的放大像.O1、O2、O0三个衍射面间的距离为 Δd.本文的目标是由O1、O2面的强度分布重建O0面的相位分布.

图3 拍摄方法示意图

CCD 拍摄的衍射像是物面O1、O2的放大像,由于显微系统的Z是固定不变的,因此拍摄的三个放大像相对于物面O0、O1、O2的放大倍率相同.原物面与其放大像的强度分布情况相同,但原衍射物面的像素大小需由物像面间的放大关系计算得出.将放大像面的像素尺寸除以显微系统的放大倍率,就得到O0、O1、O2面的实际像素大小.显微系统的放大倍率可利用已知尺寸的样品来计算.拍摄样品成像最清晰位置的放大图像,将拍摄的样品尺寸与实际尺寸相比,得到系统放大倍率(M).M=LI/LO,其中LI为拍摄尺寸,LO为样品实际尺寸.拍摄尺寸LI=NΔξ,其中N表示样品所占像素数量,Δξ表示CCD 单个像素尺寸.由放大像的像素大小 Δξ及系统放大倍率M,可计算出样品所在平面O0及其衍射物面O1、O2面的像素大小 Δx =Δξ/M.

1.3 相位恢复方法

已知相邻衍射面间隔距离Δd,计算出衍射物面O1、O2的像素大小 Δx,得到振幅分布即可由相位恢复方法重建O0面的相位分布.重建过程既可沿光场传播方向由物体所在O0平面向O1、O2面传播计算,也可由远离物体的O2面向物体所在面O0反向传播计算.物面O0与衍射面O1、O2间的传播满足菲涅尔近似条件.如果已知O2面的复振幅分布U2(ξ,η),那么O1面的复振幅分布可由菲涅尔变换表示为[17]：

O1、O0面的传播过程也可同样计算.公式(1)中U2(ξ,η)为O2面的复振幅分布,U1(x,y)为O1面的复振幅分布;z为传播面间的距离;k为波数,k =2π/λ;脉冲函数为公式(1)也可写作卷积形式[15]：

重建过程从衍射面O2开始,步骤如下：赋予O2面(-π,π)区间初始随机相位分布φ2,与振幅值(IO2)1/2结合,得到面的复振幅分布U2=(IO2)1/2exp(jφ2).将复振幅U2从面传播到O1面,由公式(2)计算得到面的复振幅A1exp(jφ1).将振幅A1替换为(IO1)1/2,保留相位分布φ1,合成新的复振幅U1=(IO1)1/2exp(jφ1).将U1传播至O0面,同样由公式(2)得到样品所在平面的复振幅U0=A0exp(jφ0),其中相位φ0即为样品的重建相位分布.

重建过程也可以由衍射面O0开始,由菲涅尔衍射依次计算光场传播到O1、O2面的复振幅分布,并将计算振幅替换为测量振幅,最终将O2面的复振幅分布逆向传播至O0面,提取相位信息得到重建相位分布.

2 相位显微成像实验

使用直径5 μm 的单分散聚苯乙烯微球作为成像实验的样品.用移液枪吸取20 μL 样本移入清洁的离心管中,加入2 mL 酒精试剂与样本混合均匀,然后放入超声波清洗器中超声分散1 min.用滴管从离心管中吸取样本,滴一滴在洁净的载玻片上,用镊子小心夹住盖玻片边缘轻轻盖在样品上,将盖玻片与载玻片接触的边缘均匀的滴上密封胶隔绝空气,制作好样品装片.

2.1 实验过程及结果

搭建显微系统,图4为系统光路图.激光器输出波长632.8 nm,使用奥林巴斯物镜(100 ×,NA =0.9),CCD(MV1-D2080-160-CL-12,photon focus)所拍图像像素数2 080 ×2 080,像素大小 8 μm.由电动平移台控制CCD 的移动过程,平移台可移动的最大距离为15 cm,每步最小可移动0.1 μm.物镜可以沿光场传播方向调整前后位置,控制与样品的距离.首先将CCD 调至成像最清晰的位置,采集此处的图像.此时样品与成像面间的距离约为150 mm.按照1.2 节所述拍摄方式,每次将CCD 和物镜均沿传播方向移动 Δd =50 μm 的距离,采集另外两张衍射放大像.截取图像512 ×512 大小的部分,见图5(a)和5(b).

图4 显微系统光路图

采集完毕后,测量3个微球直径,计算出成像最清晰处图像放大倍数为M=80.物面的像素大小为 8 μm/M=0.1 μm,利用O1和O2面的强度分布,由1.3 节所述相位恢复方法重建物体完整光场信息,结果见图6(a)和6(b).

图5 拍摄的像面.(a)CCD从焦面移动50μm所拍图像;(b)CCD从焦面移动100μm所拍图像

图6(a)为重建的样品相位信息,从相位分布情况可以清晰地看出微球厚度从中心到边缘是径向变化的.如果仅从图6(c)样品的强度分布上则无法观测出有厚度分布变化的情况.如果得知样品的折射信息,结合相位去包裹算法,可以应用于计算样品的真实厚度值.

图6 重建结果.(a)重建物体O处的相位;(b)重建物体O处的振幅;(c)CCD在成像最清晰位置的成像

2.2 与只移动CCD拍摄的成像结果对比

为了进一步佐证本文提出方法的有效性,对比了只移动CCD 拍摄成像的实验结果,所用物像关系如图7所示.拍摄焦面I0及与其相距 20 mm 及140 mm的放大像面I1、I2面,见图8(a)和 8(b).Z0、Z1、Z2为 3个放大像面到物镜的距离,W0、W1、W2为样品及其衍射物面到物镜的距离.像面与物面间的放大关系为Mi=Zi/Wi(i =0,1,2).物像关系测出焦面放大倍率M0=Z0/W0=74,样品与焦面距离约为W0+ Z0=165 mm.解得W0=2.178 6 mm,Z0=162.8214 mm,焦距f=2.1498 mm.由物像关系计算每个物面与物镜的距离W1=2.172 8 mm、W2=2.164 5 mm.三个物面的像素大小为 8 μm/M0=0.1 μm.O1、O2面间的距离为W1- W2=8.3 μm,O0与O1面的距离约为W0- W1=5.8 μm.解出M1、M2,算出I1、I2面与I0面的放大率比值Xi=Mi/M0(i =1,2),I1、I2面按照1/Xi缩放比例进行缩小,得到物面O1、O2的强度分布.由强度分布对物体进行相位恢复,重建结果如图9所示.

图7 移动CCD拍摄方法的物像关系示意图

结果显示,只移动 CCD 拍摄的成像方法,由1.1 节所述原因,在高倍大数值孔径的显微系统中并不能重建相位结果.结合2.1 及2.2 节的成像结果,证实了本文所提出显微成像方法,应用于高倍大数值孔径物镜系统的有效性.本文所提出的拍摄方式,CCD 采集的三个放大像,因为像距相同,放大倍率是相同的.因此不必由物像关系计算每个物面与样品的距离,省去了物像面缩放转换的过程,与传统移动 CCD 的拍摄方式相比,计算过程更加简洁.

图8 拍摄的像面与转换后的物面.

图9 仅移动CCD拍摄成像的重建结果.

3 结 论

本文通过将相位恢复与显微成像相合,提出了一种适用于高倍物镜显微系统的相位显微方法.由100 ×显微系统,成功重建了5 μm 直径微球样品的相位分布,证实了所提出的相位显微方法的有效性.该方法相对于干涉方法的显微方法优势在于光路及计算过程均更加简便.本工作对于生物医学样品折射率或厚度分布计算具有实际应用意义.