基于外物提取的普洱茶抗氧化活性成分分析

王绍梅

基于外物提取的普洱茶抗氧化活性成分分析

王绍梅

滇西科技师范学院生物技术与工程学院, 临沧 云南 677000

为了研究普洱茶在不同发酵过程中的化合物及其抗氧化活性成分，本文通过蒸馏萃取法对普洱茶进行外物提取，随后在提取物上分别采用GC-MS方法分析化合物组成成分，并采用DPPH和FRAP方法分析不同发酵过程中的普洱茶提取物的抗氧化活性。研究结果表明，普洱茶的外物提取溶液的抗氧化活性先上升后下降，总体出现显著上升。外物提取的总体抗氧化活性出现显著的提升。经过发酵后的普洱茶中具有较多的挥发性物质，具有较强的DPPH自由基清除活性和总体的抗氧化活性。单独的1,2,3-三甲氧基苯对于DPPH自由基的清除能力较多，说明抗氧化活性一般由组合化合物完成，单独化合物抗氧化性偏弱。

普洱茶; 提取物; 抗氧化性

普洱茶是一种以云南大叶类茶树叶青毛茶为主要原料，经过发酵之后产生了不同的化学变化，并产生了独特的香气[1-3]，由于其具有较强的保健功能，因此深受大多数人的喜爱[4]。与制作原料中的青毛茶相比，发酵后的普洱熟茶中的各种化学物质都发生了变化，并在发酵过程中产生了独特香气[4]。针对发酵后的普洱茶产生香气的成分分析，已经有研究表明是普洱茶提取物中的香气主要来源于醇类和甲氧基苯化合物组成。由于普洱茶的外物提取方式是不密封的，因此在霉菌的作用下回产生大量的芳香类化合物，产生甲基化等氧化反应[5]。其氧化反应随着时间周期呈现先增加后衰减的趋势[6]；较强的抗氧化活性又能够抑制存在于普洱茶中的脂类化合物发生氧化反应造成不可逆的营养流失[7]。研究表明，通过不同溶剂在普洱茶中提取到的提取物在对DPPH自由基清除能力不同，其中的水提取物、乙醇沉淀物和乙酸乙酯提取物在对羟自由基的清除效果最好[8]。存在于普洱茶的乙酸乙酯和正丁醇化合物的组合物在实验研究中产生了强烈的DPPH和羟基等自由基的清除率，这说明了该组合化合物具有良好的抗氧化活性[9]。

与其他茶叶品种不同，普洱茶在外物提取上具有较大的差异[10]。因此，研究不同发酵阶段的普洱茶的外物提取对于完善普洱茶在不同功效和抗氧化活性的规律上都具有重要的意义。因此，本文以不同发酵程度的普洱茶样品作为实验对象，通过外物提取的方法分析不同发酵程度的普洱茶的化学成分，并在此基础上通过DPPH和FRAP方法测定出普洱茶的抗氧化活性分析。

1 实验材料与实验方法

1.1 实验材料

下表1给出了普洱茶外物提取抗氧化活性分析的试剂情况。在本文中，选择的化学试剂都是普洱茶的主流试剂[11]。

表 1 普洱茶外物提取抗氧化活性分析的试剂使用情况表

表2则给出了普洱茶外物提取抗氧化活性分析的仪器与设备使用情况。在仪器与设备使用中，可以是采用主流的普洱茶实验使用的仪器与设备[10]。

表 2 普洱茶外物提取抗氧化活性分析的仪器与设备使用情况表

1.2 实验方法

准确称去普洱茶叶样品100.0 g，为了完成对普洱茶的外物提取，使用50 mL二氯甲烷将茶叶样品放入蒸馏萃取容器中对外物提取3 h，随后采用无水硫酸钠完成对提取物的干燥和过滤，获取普洱茶样品的无水乙醇容易，然后对无水乙醇溶液完成DPPH清除自由基的抗氧化活性测定[12]。

取出4.0 mL的普洱茶提取物进行抗氧化活性测定，测定中采用1.0 mL无水乙醇和浓度为0.2 mmol·L-1的DPPH溶液1.0 mL，在阴凉处混合后静置30 min观察抗氧化活性。为了分析抗氧化活性的显著性，采用相同的方式不加入普洱茶提取作为实验对照组。此外，还需要测定1.0 mL待测溶液与3.0 mL无水乙醇溶液的吸光度作为空白对照组3。在实验结果中，我们计算DPPH清除率，每个样品同时测定3次并取平均值作为相应的清除率，清除率的计算过程为：

(%)=[1-(1-3)/2]×100 (1)

其次，我们对普洱茶的外物提取进行FRAP测定，测定其总体的抗氧化能力[13]。]在对普洱茶外物提取的样品总抗氧化能力的测定中，准备吸取样品溶液200 μL，加入2.0 mL配置好的TPTZ工作溶液，在37 °C的水浴中反应30 min，并测定在593 nm位置处的吸光度。

2 结果与分析

在对普洱茶外物提取的抗氧化活性测定基础之上，挥发性成分根据 GC-MS 分析得到的各色谱峰，在假设检验上采用SPSS平台提供的样本检测，分析抗氧化活性的显著性。

2.1 普洱茶外物提取的挥发性成分分析

表3给出了普洱茶主要化合物成分的抗氧化活性与外物提取成分含量的对比表，并且给出了DPPH和FRAP的相关系数分析。在表3中，A表示原料样品，B表示一翻样品，C表示二翻样品，D表示三翻样品，E表示四翻样品，F表示五翻样品，G表示出堆样品，**表示0.01概率条件下的显著性，*表示0.05概率条件下的显著性。一般来说，普洱茶的原料香气物质来源于芳香族醇类、萜类、醛类等化合物，普洱茶在经过渥堆反应以后，蕴藏在茶叶中的大量化合物都发生了一些化学变化，产生了具有较强抗氧化活性的甲氧基苯化合物，这些化合物共同提升了普洱茶在发酵过程中的抗氧化活性。与此同时，在普洱茶中产生香气的萜类和醇类化合物则出现了微小的减少，呈现不太显著的减小趋势。

表 3 普洱茶不同发酵阶段香气含量及抗氧化活性相关系数

2.2 甲氧基苯的DPPH自由基清除能力分析

经过实验，我们通过SPSS平台提供的假设检验工具计算DPPH自由基的清除能力。下图1(a)给出了测定不同浓度的1,2,3-三甲氧基苯乙醇溶液DPPH自由基清除率。为了进行横向比较，我们将维生素C作为对比试验组，分析维生素C与不同浓度的1,2,3-三甲氧基苯乙醇溶液在DPPH自由基上的清除能力，从而反应出了抗氧化活性的显著性。现有研究结论指出[14]，普洱茶中的1,2,3-三甲氧基苯的含量范围在[0, 20 mg·mL-1]之间，根据实验中采用的100.0 g的普洱茶样品，且外物提取结果已经通过乙醇溶解到40 mL，所以我们可以确定在进行DPPH自由基清除计算之前普洱茶提取物中的1,2,3-三甲氧基苯的浓度在[0, 20 mg·mL-1]之间。因此，我们在该浓度下进行维生素C和1,2,3-三甲氧基苯乙醇溶液在DPPH自由基上的清除能力，图中的结果表明了的半清除率远大于维生素C，而维生素C具有较强的抗氧化能力，因此普洱茶提取物中的1,2,3-三甲氧基苯乙醇溶液仅仅只有较弱的抗氧化活性能力。

图 1 普洱茶外物提取溶液的DPPH自由基清除率和FRPA总体抗氧化值

2.3 基于FRPA方法的抗氧化能力分析

在实验中，我们基于FRPA方法分析普洱茶提取物的总体抗氧化性，通过FeSO4的标准曲线完成对FPRA的总体抗氧化性分析：=7.7372-0.0189 (2=0.9998) (2)

根据FRPA的计算可以得出如图1(b)中给出的FRPA的总体抗氧化值，图中的横坐标表示的是不同翻的次数。对比结果表明了发酵程度越高，年限越久的普洱茶，在总体抗氧化活性上效果更好，随着程度的提升具有明显的上升的趋势。总体抗氧化活性在第E列（第4翻的普洱茶）中达到了最高值(0.099 mmol·L-1)，随后的抗氧化活性出现震荡，与原始普洱茶样品相比获得了296%的提升，相应的DPPH自由基的清除率变化趋势则是保持了与抗氧化活性相同的变化趋势。

2.4 普洱茶提取物的主要成分含量与抗氧化活性相关性分析

通过假设检验检验完成对普洱茶提取物的主要成分含量和抗氧化活性相关性分析（表1），从表3中可以看出，顺势芳樟醇、反式芳樟醇以及1,2-二甲氧基苯呈现出非常强烈的DPPH自由基清除效果，并且该三种主要化合物呈显著的正相关性，经过检验分别为0.737(<0.05)，0.796 (<0.01)，0.917 (<0.01)。在总体抗氧化活性分析的FRPA分析结果中，该三种化合物中的甲氧基苯和芳樟醇等化合物之间显示出了显著的正相关性，相关系数结果分别是0.803 (<0.05), 0.641 (<0.05)，与其他的甲氧基苯类化合物和芳樟醇氧化都有不太显著的正相关性。DPPH和FRAP的两种方法的测定结果则显示出了明显的正相关性，相应的相关系数为0.923(<0.01)。

3 讨论与结论

从文中的实验结果可以看出，普洱茶在不同发酵阶段的普洱茶的外物提取溶液的抗氧化活性先上升后下降，总体出现显著上升。外物提取的总体抗氧化活性出现显著的提升[15]。经过假设检验分析相关系数发现，普洱茶提取物中的抗氧化活性来自于甲氧基苯和芳樟醇等化合物中，具有显著的正相关性，该结果表明了普洱茶的抗氧化活性与甲氧基苯和芳樟醇氧化物的含量有关，增加这些化合物的不但能够显著的提升陈年普洱茶中的特殊香味的持久性，而且能够提升普洱茶中各种化合物的抗氧化活性，避免化合物过早的发生氧化造成普洱茶香气的变化。

实际上，由于茶叶中的化学成分较多，并且不同的化学成分具有不同的抗氧化活性，作为复杂的化合物综合体，普洱茶的抗氧化能力是各个化合物综合表达的结果[16]。在众多的化学成分中，多酚类化合物是普洱茶中的重要抗氧化活性物质之一。今后的研究方向包括通过更为细致的外物提取方法，从普洱茶中提取出各种单独化合物并分析其抗氧化能力，然后通过各种不同的组合，分析不同化合物在抗氧化能力上的协同作用，进一步挖掘普洱茶的抗氧化活性。

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The Analysis of Antioxidant Active Ingredients Extracted from Pu-Erh Tea by Foreign Objects

WANG Shao-mei

677000,

In order to research the chemical compound elements and the antioxidant activity of the Pu-Erh Tea under different fermentation procedures, this paper used the distillation extraction algorithm to extract foreign objects from the Pu-Erh Tea, and used the GC-MS algorithm, DPPH algorithm, and FRAP algorithm to analyze the chemical compound elements and the antioxidant activity of the Pu-Erh Tea under different fermentation procedures. Experimental results have shown that the antioxidant activity of the Pu-Erh Tea from the object extraction liquor have a first growing up then reducing antioxidant activity, and the totally antioxidant activity is rising. The totally antioxidant activity for the object extraction from Pu-Erh Teahave the significant improvements. By fermentation, the object extraction from Pu-Erh Tea has much more volatile matters, which have strong DPPH free radical scavenging activity and totally antioxidant activity. The single 1,2,3-trimethoxybenzene have a better ability to DPPH free radical scavenging, and such results have shown that the strong totally antioxidant is built from the combination of chemical compound elements, but the single chemical compound elements has a less antioxidant activity.

Pu-Erh Tea; extract; antioxidant activity

TS272.5;Q946.91

A

1000-2324(2019)02-0319-04

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.02.031

2018-03-06

2018-04-15

王绍梅(1967-),女,教授,高级评茶技师,高级茶艺技师. E-mail:lc_wangshaomei@163.com