硝态氮对组培‘嘎拉3’叶绿素合成及相关基因表达的影响

文滨滨,张新昊,沈红艳,陈修德1,,高东升1,,朱翠英*,肖伟1,*



硝态氮对组培‘嘎拉3’叶绿素合成及相关基因表达的影响

文滨滨2,张新昊2,沈红艳2,陈修德1,2,高东升1,2,朱翠英2*,肖伟1,2*

1. 山东果蔬优质高效生产协同创新中心, 山东 泰安 271018 2. 山东农业大学园艺科学与工程学院, 山东 泰安 271018

为研究硝态氮在组培‘嘎拉3’叶绿素合成过程中的作用及其分子基础。本试验以0 mmol·L-1NO3-的MS培养基为对照组，探讨硝态氮对组培‘嘎拉3’叶绿素和光合产物含量、叶片的解剖结构以及叶绿素合成途径关键基因、、、、相对表达量的影响。结果表明：对照组叶片在14 d时叶缘开始变黄，21 d时由叶缘到叶脉变黄，茎基部无愈伤组织形成。对照组叶绿素含量在14 d时无明显变化，在21 d时下降幅度增大，相对于硝态氮处理，叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量分别下降36.67%、36.84%和26.53%。对照组叶片中可溶性糖含量在21 d后显著降低且低于硝态氮处理，淀粉含量则在7 d后显著增加，高于硝态氮处理。对照组叶片解剖结构在14 d时，栅栏组织变宽与海绵组织界限不清晰，21 d后细胞变形。、和这三个基因的相对表达量在14 d达到峰值后降低且显著低于硝态氮处理，在第7 d时达到峰值而则在第21 d达到峰值，这5个基因在缺硝态氮条件下表达趋势相似，都是先升高后降低，表明他们在叶绿素合成途径起作用。以上结果表明硝态氮通过影响叶片解剖结构和叶绿素合成途径关键酶基因的表达量来维持叶绿素含量和光合产物的相对稳定。

硝态氮; 叶绿素; Gala3; 光合产物; 基因表达

叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，是捕获光能的主要成分。叶绿素在高等植物中主要包括叶绿素a (Chlorophyll a)和叶绿素b (Chlorophyll b)两种色素。其合成过程共需要15步反应，15种酶和27个相关酶基因调控[1]。像–氨基酮戊酸(ALA)是叶绿素合成过程中的关键物质，HEMA编码谷氨酰–tRNA还原酶(GluTR)的合成，而–氨基酮戊酸(ALA)合成需要谷氨酰–tRNA还原酶(GluTR)的催化[2,3]，主要编码尿卟啉原Ⅲ合成酶的合成，在羟甲基胆色素原(Hydroxymethylbilane)催化合成尿卟啉原Ⅲ (UrogenⅢ)过程中发挥重要作用[1]。是组成Mg螯合酶的一个D亚基单位，在原卟啉Ⅸ (protoⅨ)生成Mg–原卟啉Ⅸ (Mg–ProtoⅨ)的过程中起到催化作用[4]，编码Mg–原卟啉Ⅸ甲基转移酶，定位于被膜和类囊体膜上，在Mg–原卟啉Ⅸ (Mg–ProtoⅨ)生成Mg–原卟啉Ⅸ甲酯(ProtoⅨ ME)过程中起到催化作用[5,6]，这两个基因在叶绿素a的合成过程中起到重要作用，直接影响叶绿素a的合成。编码原叶绿素酸酯氧化还原酶的合成，催化原叶绿素酸酯还原为叶绿素酸酯，促进ALA的合成[7,8]。

氮是植物生长发育的必需元素之一，植物主要以硝态氮(NO3–)和氨态氮(NH4+)两种形式吸收氮素，硝态氮是主要的氮素形态，在叶片中通过硝酸还原酶和亚硝酸还原酶的还原作用还原成谷氨酰胺酸盐和谷氨酸盐被同化吸收[9]。叶绿素a和叶绿素b都是含氮化合物，缺氮时植株叶片薄而小，无法正常合成叶绿素、叶色缺绿而发黄，增施氮肥以后，植株叶色转绿，生长量增加[10]。研究表明，在一定范围内，叶片含氮量增加有利于叶绿素含量增加，合理施氮可以增加叶片叶绿素含量、提高叶片的有效光合面积从而提高叶片制造碳水化合物的能力[11-13]。Nii的研究表明，桃树施氮肥以后叶片中叶绿素含量增加，叶片进行光合作用的能力增强，C的同化速率也随施氮量的增加而增加[14,15]。

叶片氮素含量通过影响叶绿素的合成来影响植物的光合作用[16]，前人研究报道通过增加氮素施用量增加叶绿素含量，从而提高植物的光合速率[17-19]，但是氮素对叶绿素合成机理的研究报道较少。基于此，我们以通过控制MS培养基中硝态氮的含量使叶片黄化、植株生长缓慢这一现象，研究硝态氮对叶绿素合成及相关基因表达和碳水化合物含量的影响，为阐明氮在叶绿素合成过程中的内在机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验于2018年3月在山东农业大学园艺科学与工程学院进行，所用培养基为MS培养基，实验材料为继代后1个月‘嘎拉3’(Malus x domestica ‘ Gala 3’)组培苗。

实验共设2个处理: (1)正常MS培养基培养, (2)用NH4Cl、KCl代替NH4NO3、KNO3的MS培养基培养。将生长一个月且长势均匀一致的‘嘎拉3’组培苗继代于两种不同的培养基中，3次重复，每瓶3株，隔一周取样一次。

1.2 测定指标与方法

1.2.1 叶绿素含量的测定叶绿素含量的测定采用赵世杰等的方法[20]。

1.2.2 光合产物的测定可溶性糖含量和淀粉含量的测定均采用蒽酮法[20]。

1.2.3 叶片显微结构的观察石蜡切片的制作：取样时将‘嘎拉3’组培苗叶片切成0.5 cm2左右的小块，FAA固定液固定后用真空机抽真空，制作石蜡切片[21]，番红固绿染色。切至8 μm的厚度。在Leica光学显微镜下观察叶片的显微结构并拍照。

1.2.4 叶绿素合成相关基因的表达分析分别取两种培养基处理后0，7，14，21，28 d的组培‘嘎拉3’叶片，置于液氮中速冻后放–80 ℃冰箱备用。总RNA的提取用TIANGEN（天根）试剂盒，然后进行琼脂糖凝胶电泳，证实RNA有18S和28S两条明显的完整条带。以提取的RNA为模板，用反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time, TaKaRa)进行反转录获得cDNA，采用SYBR®Premix ExTM(Tli RNaseH Plus)试剂盒(宝生物)进行荧光定量PCR反应。引物设计在Phytozome 10.3中找到基因的序列，采用软件DNAMAN设计荧光定量特异性引物（表1）。最终采用Comparative CT(2–ΔΔCt)法进行数据分析[22]。

表1 RT–PCR所用引物

1.3 数据处理

数据差异性分析采用spss20.0，整理与统计使用Excel，作图使用Graphpad Prism 6。

2 实验结果

2.1 组培‘嘎拉3’外观形态

使用canon eos 60d相机拍摄硝态氮处理和对照组的‘嘎拉3’组培苗(图1)。结果表明，硝态氮处理7 d以后，与对照组相比整体生长势无显著差异，对照组部分老叶从叶缘开始出现黄化现象。硝态氮处理14 d后，培养基中的茎段发生显著变化，基部愈伤组织形成明显且开始膨大，对照组无愈伤组织形成，开始黄化，整体生长势仍无显著差异。21 d后，植株发生明显的差异，硝态氮处理的植株，叶片呈正常绿色，基部愈伤组织已经分化出可见的组培苗，对照组基部明显黄化，无愈伤组织的形成，老叶开始出现明显黄化，由叶缘向叶柄转移。28 d后，硝态氮处理的植株基部愈伤分化形成的组培苗继续生长，愈伤组织变大，对照组植株开始出现整株黄化的现象，由老叶向新叶开始变黄，基部无愈伤组织的形成。

备注：A-E分别表示硝态氮处理第0、7、14、21、28 d，F–I分别表示对照组组第7、14、21、28 d。

2.2 组培‘嘎拉3’中的叶绿素含量

叶绿素是植物进行光合作用的重要色素，其含量高低直接影响植株的光合作用。硝态氮处理组培‘嘎拉3’后，叶绿素含量变化的结果表明，叶绿素a含量呈先增加后稳定的变化趋势，7 d后叶绿素含量变化差异不显著，叶绿素b含量变化不显著(表1)。对照组叶绿素含量呈先增加后降低的变化趋势，7 d后叶绿素含量增加至峰值后降低，21 d时下降幅度最大，较14 d叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素分别下降33.04%、30.77%和29.41%，与28 d差异不显著，与硝态氮处理21 d相比，叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素分别下降36.67%、36.84%和26.53%，说明硝态氮是叶绿素合成的重要物质。

表2 硝态氮对组培嘎拉3叶绿素含量的影响

备注：不同字母表示同一处理差异达5%显著水平。Note: Different letters indicate a significant 5% difference in the same treatment.

2.3 组培‘嘎拉3’中的光合产物含量

光合产物含量是衡量植株光合作用强弱的重要指标。由图2(A,B)可知，硝态氮处理‘嘎拉3’以后，叶片中可溶性糖含量呈逐渐增加的变化趋势，14 d以后叶片中的可溶性糖含量达到20.65 mg·g–1后趋于稳定，并且与21 d、28 d差异不显著。对照组叶片中可溶性糖含量呈先增加后降低的变化趋势，14 d时出现峰值21.09 mg·g–1后降低。21 d后，硝态氮处理的组培‘嘎拉3’叶片可溶性糖含量显著高于对照组，分别比对照组高26.04%和19.22%。硝态氮处理后，茎中可溶性糖含量呈先增加后降低的变化趋势，21 d时，出现峰值12.19 mg·g–1，但是14、21、28 d变化差异不显著。对照组组茎中可溶性糖含量呈先增加后降低的变化趋势，7 d时达到最大值10.77 mg·g–1后降低，14、21、28 d变化差异不显著。14 d后，硝态氮处理茎中可溶性糖含量明显高于对照，分别比对照组高27.06%、20.68%和24.90%。

图 2 硝态氮对组培‘嘎拉3’叶片和茎光合产物含量的影响

注：不同字母表示同一处理差异达5%显著水平。

Note: Different letters indicate a significant 5% difference in the same treatment.

淀粉主要在叶绿体内形成，是光合产物的主要贮存物质。由图2(C,D)可知，硝态氮处理组培‘嘎拉3’后叶片中淀粉含量呈先增加后降低然后趋于稳定的的变化趋势，叶片淀粉含量在7 d出现峰值0.24%以后，降低到处理之前的含量，并且在14、21、28 d时含量变化差异不显著。对照组叶片中淀粉含量呈逐渐增加的变化趋势，14 d后，对照组叶片中淀粉含量显著高于硝态氮处理。硝态氮处理以后，茎中淀粉含量呈逐渐增加的变化趋势，7 d达到0.37%后趋于稳定，并且7、14、21、28 d差异不显著。对照组茎中淀粉含量呈先增加后降低的变化趋势，在14 d时达到最大值0.28%，21 d时下降至处理之前的水平，28 d时相比于0 d下降幅度为62.12%。以上结果表明硝态氮是组培‘嘎拉3’进行光合作用制造光合产物的重要物质。

2.4 组培‘嘎拉3’叶片解剖结构

如图3所示，硝态氮处理以后，组培‘嘎拉3’叶肉结构完整，栅栏组织结构排列密集，呈柱形，由2~3层细胞组成，上下表皮平滑而完整，细胞主要分布在两侧，大小相似无变形，海绵组织松散均匀分布在下表皮(ACDE)。图3B栅栏组织排列空隙增大，海绵组织排列无序，但是细胞结构完整。对照组主叶脉分离的叶片横切解剖结构海绵组织细胞在第7 d时明显变大，细胞结构组织紊乱，叶肉细胞不规则；14 d时，细胞与细胞之间的距离变大，栅栏组织明显变宽呈长圆形，第三层栅栏组织与海绵组织界限不清晰，排列不规则，栅栏组织和海绵组织之间的差异变小，21 d后细胞变形，栅栏组织和海绵组织混乱排布，细胞变大；28 d后，叶肉细胞完全变形、萎缩。以上结果表明硝态氮是维持细胞结构、保证植株正常生命活动的重要物质。

备注：A–E分别表示硝态氮处理第0、7、14、21、28 d，F–I分别表示对照组组第7、14、21、28 d。

2.5 硝态氮对叶绿素合成途径关键酶基因相对表达量的影响

图4 硝态氮对叶绿素合成途径关键酶基因MdHEMA、MdHEMD、MdCHLD、MdCHLM和MdPORA相对表达量的影响

注：不同字母表示同一处理差异达5%显著水平。Note: Different letters indicate a significant 5% difference in the same treatment.

图4结果表明，在硝态氮处理以后，7 d时表达量降低，14 d后表达量变化不显著与处理之前无显著差异。对照组的下调表达，14 d时表达量达到最大值，与处理前无显著差异（图4A)。在硝态氮处理以后，表达量呈先增加后降低的变化趋势，14 d时达到最大值，随后降低。对照组的也呈先增加后降低的变化趋势，但是表达量低于硝态氮处理，21 d时达到最大值与硝态氮处理无显著差异，28 d时表达量显著降低（图4B)。硝态氮处理的表达量呈逐渐增加的变化趋势，21 d时表达量达到最大值与28 d差异不显著。对照组的呈先增加后降低的变化趋势，7 d时表达量高于硝态氮处理，14 d时，表达量达最大值，随后显著降低（图4C)。在硝态氮处理以后，呈上调表达趋势，28 d时表达量达到峰值，对照组的表达量呈先增加后降低的变化趋势，在7 d时达到峰值，7、14、21 d时变化不显著，28 d时表达量显著降低（图4D)。在硝态氮处理以后表达量呈逐渐增加的变化趋势，14 d后一致处于平稳状态，变化无显著差异。对照组的相对表达量呈先增加后降低的变化，14 d表达量达到峰值与7 d无显著差异，21 d时表达量下降与28 d无显著差异。整体而言，叶绿素合成途径基因的表达量与叶绿素含量的变化相对应，其中和在硝态氮处理后期表达量处于平稳的表达状态，硝态氮处理后呈逐渐增加的变化趋势，在28 d时达到峰值，在硝态氮处理以后呈先增加后降低的变化趋势，在14 d时，表达量达到峰值。

3 讨论

氮作为叶绿素合成过程中的重要组分，其供应情况直接影响叶绿素的含量，从而影响光合产物的合成[23]。本研究中，在持续供氮的条件下叶绿素含量呈先增加然后保持稳定的状态，而对照组中叶绿素含量呈先降低后保持稳定的变化状态，但是在7 d时，对照组叶绿素含量高于硝态氮处理，其含量变化与图1对应。由此推测硝态氮对叶绿素合成的影响是一个相对平衡的状态，在外界缺少氮素的条件下，植物会利用体内老叶和茎段中贮存的氮素来满足新叶正常合成叶绿素的需要。所以在一段时间内，叶绿素含量不会降低，相反会因为缺少氮素的条件使植物合成更多的叶绿素，这与李彩和李林峰的研究结果一致[17,24]。缺氮能够显著降低植株叶绿素的含量，而叶绿素含量的高低直接影响光合产物的含量[25]。本试验结果表明，硝态氮处理以后，叶片和茎中可溶性糖含量呈先增加后稳定的变化趋势，而对照组则呈先增加后降低保持稳定；叶片中淀粉含量的变化与可溶性糖含量变化呈相反的变化趋势，茎中淀粉含量在硝态氮处理后增加，7 d以后差异不显著，但是对照组却呈先增加后降低的变化趋势，由此可以说明培养基中缺少硝态氮以后，植株利用体内的贮藏氮素正常合成叶绿素，制造光合产物，以淀粉的形式贮藏在叶片中，而茎中淀粉含量降低可能由于叶和茎的源库关系发生改变，叶片不能正常光合作用制造光合营养，茎中的淀粉在淀粉浓度梯度和膨压差的动力下转移到叶片[26,27]。

植物细胞形态和生理功能密切相关，正常的细胞形态和器官构造是植物进行正常生命活动的基础[28]。王亚菲认为植物受到缺氮胁迫以后，叶片代谢异常，细胞以及亚细胞形态发生改变，供氮正常后细胞形态稳定，叶片厚度增加[29]。本实验结果表明，硝态氮处理和对照组叶片厚度无显著差异，并且角质层较薄，这与前人的研究结果不一致[30]，可能是因为本研究实验材料在组培瓶内，湿度大、养分足、内环境稳定，叶片的显微结构和水生植物相似。对照组组叶片栅栏组织和海绵组织的厚度比发生显著的改变，后期细胞形态明显变形，叶绿素含量以及光合产物含量减少，而硝态氮处理后的叶片形态无明显变化，栅栏组织发达，叶肉细胞间隙较小，叶绿素和光合产物含量稳定后无显著变化。对照组叶片结构的这些变化影响了气孔的正常开闭和细胞的正常生命功能进而影响植物叶绿素的合成以及光合产物的运输。

叶绿素在光能转换成化学能的过程中发挥重要作用，其含量的高低直接影响植物的光合作用[31]。在拟南芥中鉴定到叶绿素合成的关键结构基因过表达或者沉默都能影响植物叶绿素的含量从而影响植物的光合作用。本研究结果表明，硝态氮处理以后，叶绿素合成途径的5个关键基因、、和相比于对照组组均呈上调的表达模式，与叶绿素含量结果相对应，表明这5个基因调控叶绿素的合成，不同的是硝态氮处理以后，和这三个基因表达量达到高峰以后，持续稳定表达无显著差异，对照组中和这三个基因表达量均在14 d时达到峰值随后降低。在硝态氮处理以后呈逐渐上调的表达模式，与前期表达量呈显著差异，而对照组中相对表达量在28 d后显著降低。在硝态氮处理以后呈先增加后降低的变化趋势，说明ALA可能主要是在谷氨酰–tRNA还原酶的催化作用下合成，而原叶绿素酸酯氧化还原酶的催化作用不显著。以上结果可以推测对照组在缺硝态氮的条件下，依然可以利用自身储存的氮素合成叶绿素，从图1可以看出，老叶先变黄，并且由叶缘转移到叶脉，说明硝态氮的运输是从老叶转移到新叶，当老叶中硝态氮耗尽以后，不能正常合成叶绿素从而导致叶绿素含量的降低和叶绿素合成相关基因的下调表达。

4 结论

因此，硝态氮在叶绿素合成途径中发挥重要作用，并且通过影响叶片的解剖结构和叶绿素合成途径关键酶基因的变化来影响叶绿素的合成及光合产物含量的变化。

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Effects of Nitrate Nitrogen on Chlorophyll Synthesis and Related Genes Expression of ‘Gala 3’ in Tissue Culture

WEN Bin-bin2, ZHANG Xin-hao2, CHEN Hong-yan2, CHEN Xiu-de1,2, GAO Dong-sheng1,2, ZHU Cui-ying2*, XIAO Wei1,2*

1.271018,2.271018,

The effects of nitrate nitrogen on chlorophyll synthesis and its molecular basis of ‘Gala 3’ in tissue culture were studied. In this study, MS medium of 0 mmol·L-1NO3- as the control group, the effect of nitrate nitrogen on chlorophyll and photosynthetic content, leaf anatomical structure and relative expression levels of key genes,,,andin the chlorophyll synthesis pathway of ‘Gala 3’ in vitro plantlets were studied. The results showed the leaves of the control group began to turn yellow at the leaf edge at 14 d, from leaf edge to vein at 21 d, and without callus formation at the stem base. The chlorophyll content in the control group did not change significantly at 14 d, but decreased significantly at day 21, the content of chlorophyll a, chlorophyll b and carotenoid decreased by 36.67%, 36.84% and 26.53%, respectively, compared with nitrate nitrogen treatment. The content of soluble sugar decreased significantly in leaves after 21 d and was lower than that of nitrate treatment, the content of starch increased significantly after 7 d, and was higher than that of nitrate nitrogen treatment. In the control group, when the anatomical structure of the leaves was 14 d, the palisade tissue widen and the boundary between palisade tissue and sponge tissue was not clear, the cells were deformed after 21 d. The relative expression levels of the three genes,andwere decreased significantly after the peak at 14 d and were significantly lower than those of nitrate nitrogen treatment.reached the peak on the 7th day and thewas at 21st day. These 5 genes expressed similar tendency under the condition of no nitrogen–deficient, all of them increased first and then decreased, indicating they play the role in chlorophyll synthesis pathway. The above results indicate that nitrate nitrogen can maintains the relative stability of chlorophyll content and photosynthetic products by affecting the anatomical structure of leaves and the expression of key enzyme genes in the chlorophyll synthesis pathway.

Nitrate nitrogen; chlorophyll; Gala3; photosynthetic product; gene expression

TQ611.5

A

1000-2324(2019)02-0179-07

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.02.001

2018-06-28

2018-09-13

山东省现代农业产业技术体系果品创新团队项目(SDAIT-06-01)

文滨滨(1993-),男,硕士,研究方向:果树生理与分子. E-mail:wbbsdau@163.com

Author for correspondence. E-mail:chunying196217@163.com; gulight986918@163.com