牛羊乳粉中掺入大豆蛋白的特征性蛋白组分分析

张 悦

（陕西省产品质量监督检验研究院农副食品所，陕西西安 710048）

随着经济的发展，我国人均年饮奶量大幅度提高，而现阶段仍然存在乳品生产掺假行为[1]。现阶段检测掺假的方法也一直在更新探索，如利用特有氨基酸检测[2-3]、利用蛋白质的溶解性差异检测、利用蛋白质的抗原特异性检测等，其涉及了色谱、质谱、免疫、PCR、电泳、光谱等多种检测技术[4]。

现阶段已有研究利用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳检测牛奶中掺入的豆奶蛋白[5]，而研究从牛、羊乳蛋白和大豆蛋白化学特性的异同上，通过SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳来区分乳蛋白和大豆蛋白的特征性蛋白质组分，进而能定量鉴定大豆蛋白的掺假检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

牛、羊乳粉和大豆蛋白粉，购于西安银桥乳业集团公司。

1.1.2 试剂

三羟甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸钠（SDS）、过硫酸铵（APS）、N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺、甘氨酸、考马斯亮蓝R-250、冰醋酸、甲醇、溴酚蓝（BPB）、低分子量蛋白Maker。

1.1.3 设备

生物电泳图像分析系统、电子天平、伯乐小型垂直电泳槽、电泳供电装置、电热恒温水浴锅、pH计等。

1.1.4 分析软件

使用Quantity One（美国伯乐） 对SDS-PAGE凝胶电泳结果进行分析处理。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的制备

采用凯氏定氮法测定牛乳粉、羊乳粉、大豆蛋白粉的总蛋白质含量。计算样品的蛋白质量浓度，使得SDS-PAGE电泳时上样质量浓度保持在1 μg/μL。

在各离心管中加入80 μL样品溶液和20 μL上样缓冲液，混匀，并于95℃水浴加热5 min，自然冷却后放4℃保存，准备电泳试验。

1.2.2 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳

（1）按照乳的蛋白分布。下层凝胶（12.5%） 和上层凝胶（4%）配制方法。

凝胶电泳凝胶buffer见表3。

表3 凝胶电泳凝胶buffer /μL

电泳分2步进行S1：80 V，15 min；S2：120 V，3 h并根据需要结束电泳。

（2）考马斯亮蓝染色分析。染色液静置过夜后，脱色过夜，将凝胶放置于生物电泳图像分析系统中成像，使用Quantity One软件分析试验结果。

1.2.3 牛、羊乳粉和大豆蛋白SDS-PAGE电泳分析

通过SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳比较乳蛋白和大豆蛋白的蛋白质组分异同。

1.2.4 牛、羊乳粉中分别掺入梯度大豆蛋白鉴别

分别按0，5%，10%，15%，20%，25%，30%的质量分数梯度向牛、羊乳粉中掺入大豆蛋白粉，通过SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳找出了区分乳蛋白和大豆蛋白的特征性大豆蛋白，并对其进行定量。

2 结果与分析

2.1 牛、羊乳蛋白和大豆蛋白组分比较

牛、羊乳蛋白和大豆蛋白电泳分析图见图1。

图1 牛、羊乳蛋白和大豆蛋白电泳分析图

由图1分析可知，乳中主要蛋白酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白都得到了明显分离，与唐萍等人[6]检测到的电泳条带基本一致，牛、羊乳蛋白组分和大豆蛋白组分有显著区别，其中大豆蛋白组分中，分子量在46～58 kDa时有2个特征的组分条带，分子量在17 kDa附近也有一条特征组分条带。

2.2 牛、羊乳粉分别掺入不同梯度大豆蛋白鉴别结果

牛、羊乳粉分别掺入质量分数梯度（0，5%，10%，15%，20%，25%，30%）大豆蛋白进行鉴别。

牛乳蛋白掺入不同质量分数梯度大豆蛋白质电泳分析图见图2。

图2 牛乳蛋白掺入不同质量分数梯度大豆蛋白质电泳分析图

由图2可知，随着掺入的大豆蛋白添加量越大，牛乳蛋白固有条带间增加的数条大豆蛋白条带的含量逐渐增加，大豆蛋白中的3种特征性蛋白组分A，B，C的占比也越大，其光密度也越大，且都随加入量的增加有显著的线性关系，其线性关系见图3。这与宋宏新等人[7]利用SDS-PAGE法分析牛乳蛋白中掺假大豆蛋白粉的情况一致；因此，可以挑选出蛋白组分A，B，C作为大豆蛋白的特征性组分，找出的特征性大豆蛋白组分A占比（光密度占整个大豆蛋白组分光密度的百分比）28%，蛋白组分B占比20.5%，蛋白组分C占比19.4%，其中蛋白组分A的分子量在23 kDa附近，蛋白组分B的分子量在58 kDa附近，蛋白组分C的分子量在46 kDa附近。

特征大豆蛋白组分A，B，C光密度与大豆蛋白添加量的线性关系（牛乳） 见图3。

综合大豆蛋白的特征组分A，B，C，确定最后向牛乳粉中掺入大豆蛋白的添加量与特征组分光密度的线性关系：Y=1.011X+7.857，R2=0.971。

牛乳粉中掺入大豆蛋白的添加量与特征组分光密度的线性关系见图4，羊乳蛋白掺入梯度大豆蛋白电泳分析图见图5。

图3 特征大豆蛋白组分A，B，C光密度与大豆蛋白添加量的线性关系（牛乳）

图4 牛乳粉中掺入大豆蛋白的添加量与特征组分光密度的线性关系

由图5可知，随着掺入的大豆蛋白添加量越大，大豆蛋白中的3种特征性蛋白质组分A，B，C的占比也越大，其光密度也越大，且都随添加量的增加有显著的线性关系。

图5 羊乳蛋白掺入梯度大豆蛋白电泳分析图

特征大豆蛋白组分A，B，C光密度与大豆蛋白添加量的线性关系（羊乳） 见图6。

图6 特征大豆蛋白组分A，B，C光密度与大豆蛋白添加量的线性关系（羊乳）

综合大豆蛋白的特征组分A，B，C，确定最后向羊乳粉中掺入大豆蛋白的添加量与特征组分光密度的线性关系：Y=1.283X+3.803，R2=0.966。

羊乳粉中掺入大豆蛋白的添加量与特征组分光密度的线性关系见图7。

综上所述，用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，可以快速直观地反映大豆蛋白粉掺入乳粉的情况，且效果显著。

3 结论

（1）牛、羊乳蛋白组分与大豆蛋白组分有显著区别。

（2） 找出了特征性大豆蛋白组分A占比28%，蛋白组分B占比20.5%，蛋白组分C占比19.4%，且都随添加量的增加有显著的线性关系。

图7 羊乳粉中掺入大豆蛋白的添加量与特征组分光密度的线性关系

（3）选取特征性大豆蛋白组分A，B，C建立综合曲线，得到大豆蛋白掺假乳蛋白的线性关系：大豆蛋白掺入牛乳粉中（Y=1.011X+7.857，R2=0.971），大豆蛋白掺入羊乳粉中（Y=1.283X+3.803，R2=0.966）。