miR-182在老年慢性心力衰竭病人循环中的表达及意义

多种微小RNA(microRNA,miR)在心脏中特异性表达或高表达,且调控着心肌细胞的分化、肥大、增殖和凋亡等功能,其中miR-1、miR-133、miR-208、miR-499等认为是心肌发育调控的重要参与者[1-3]。心力衰竭(心衰)是一系列心血管疾病的最终结果,在心衰进展过程中的典型表现是心肌重构和心肌间质纤维化。miR-133、miR-21、miR-210、miR-499等多种miRNA在心衰时表达水平明显增加,表明这些miRNAs参与了心脏病理性肥大及心衰的发生,从而可以成为有效的心衰生物标记物[4-8]。本研究旨在观察miR-182在老年慢性心衰病人循环中的表达,以及不同心功能分级中miR-182表达水平的变化,探讨miR-182在老年慢性心衰诊断及预后中的判断价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2016年10月至2017年4月在我院住院符合Framinghan诊断标准的慢性心衰的老年病人94例(心衰组),参照美国纽约心脏病学会(NYHA)分级,其中NYHAⅡ级32例,NYHAⅢ级32例,NYHA Ⅳ级30例。排除急性感染、自身免疫性疾病、严重肝肾功能不全、恶性肿瘤病人。并选取同期健康体检老年人31例为对照组。本研究所有入选病人均签署知情同意书,并经我院伦理委员会批准(ZPYYLL-2015-23)。

1.2 研究方法

1.2.1 临床资料:专人测量身高、体质量。全自动生化仪测定血常规、肝肾功能、C反应蛋白(CRP)。

1.2.2 N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)检测:空腹抽取静脉血2 mL,肝素抗凝,采用电化学发光法自动免疫仪检测血浆NT-proBNP。

1.2.3 miR-182分析:采用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术检测miR-182表达情况。以RNeasy Plus RNA试剂盒(QIAGEN公司)提取血浆总RNA,测定RNA浓度,对符合A260/A280 比值为1.8～2.0的总RNA才进行下一步qRT-PCR反应。以SuperScript Ⅲ试剂盒(Invitrogen公司)合成cDNA,以QuantiTect SYBR Green 试剂盒(QIAGEN公司)进行qRT-PCR:cDNA稀释10倍。miR-182的茎环引物序列:正向5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTG CACTGGATACGACAGTGTG-3′,反向5′-TTTGGCAATGGTAGAACTCA-3′。以U6为内参,茎环引物序列:正向5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATT GCACTGGA TACGACAAAATATG-3′,反向5′-TTAGCATGGCCCCTGC-3′。采用386孔板20μL体系(2x SYB Green 10μL,稀释后的cDNA 7μL,10μmol/L混合后的引物3μL)。50°C 2 min 1个循环;95°C 10 min,1个循环;95 °C 15 s、 60 °C 30 s、 72 °C 30 s,40个循环;72°C 10 min,1个循环。于ABI 7900荧光 PCR仪进行。采用2-ΔΔCt法进行相对定量。

1.2.4 超声心动图检查:采用美国HP5500型彩色多普勒超声心动图仪,探头频率2.5 MHz,测定左室射血分数(LVEF)。

2 结果

2.1 2组一般临床资料比较 对照组与心衰组比较,年龄、性别、体质量指数(BMI)及白蛋白、血红蛋白(Hb)水平差异无统计学意义(P>0.05),而尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 血浆miR-182、NT-proBNP、CRP水平及LVEF比较 经方差齐性检验,miR-182、NT-proBNP、CRP、LVEF均不齐,予非参数检验。结果显示,心衰组血浆miR-182、NT-proBNP、CRP水平与对照组比较明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。心衰组LVEF与对照组比较明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表1 2组一般临床资料比较

注:与对照组比较,*P<0.05

表2 2组循环miR-182、NT-proBNP、CRP水平及LVEF比较

注:与对照组比较,**P<0.01

2.3 相关性分析 Spearman相关分析显示,miR-182与性别、BMI、CRP无相关关系(P>0.05),与年龄、BUN、Cr、NT-proBNP、心功能分级呈正相关(P<0.05),与白蛋白、Hb、LVEF呈负相关(P<0.05)。NT-proBNP与年龄、BUN、Cr、CRP、心功能分级呈正相关(P<0.05),与BMI、白蛋白、Hb、LVEF呈负相关(P<0.05)。见表3。

表3 心衰组miR-182、NT-proBNP与各指标的相关分析

2.4 ROC曲线分析 miR-182诊断心衰的AUC为0.751,95%CI为0.658～0.843,敏感度为40.4%,特异度为93.5%。NT-proBNP诊断心衰的AUC为0.896,95%CI为0.843～0.949,最佳临界值为618 ng/L,此点其敏感度为75.5%,特异度为100%。两者AUC比较,差异有统计学意义(P<0.01)。

3 讨论

老年慢性心衰病人症状和体征多为非特异性,且行动不便不易配合外出检查,早期确诊有一定困难[9]。目前,临床多通过检测BNP/NT-proBNP来协助早期诊断慢性心衰。但BNP或NT-proBNP不仅在一些非心血管疾病中会升高,也受年龄、BMI、肾功能等影响。因此,我们一直在寻找相对更理想的生物学标记物早期诊断老年慢性心衰。

miR-182属于miR-183/96/182簇的一员,定位于人7号染色体,在多种细胞和组织中表达,如成骨细胞、淋巴细胞、视网膜、内耳以及脂肪组织等[10-12]。miR-182可通过调节不同的靶mRNA对生物体的生长、发育、分化发挥重要调控作用,尤其是在肿瘤的形成和发展中发挥重要作用[13-14]。近年来研究发现,miR-182在糖、脂代谢的调控方面发挥着重要作用,其表达的紊乱可能会导致肥胖和糖尿病等代谢相关疾病以及动脉粥样硬化的发生[15-16]。我国学者发现,miR-182通过抑制靶基因Racl可以抑制高糖诱导的心肌细胞肥大[17]。心肌细胞肥大是心功能降低的主要结构改变,由此可推测miR-182可能参与心衰的发生。之后的研究证实了这个推论。Cakmak等[18]通过微阵列分析不同NYHA分级(Ⅱ～Ⅳ)病人及健康对照人群的miRNA,结果显示miR-182在心衰病人中明显升高,进一步分析ROC曲线的AUC,发现miR-182判断心衰的预后方面优于NT-proBNP及hs-CRP。我们的研究显示,miR-182在心衰病人中的表达明显高于健康对照人群,进一步行相关性分析,发现miR-182与NT-proBNP呈正相关(r=0.352,P<0.01)、与LVEF呈负相关(r=-0.246,P<0.01),而且随着心功能的下降逐渐升高(r=0.461,P<0.01),提示miR-182在心衰的诊断及预后判断方面具有一定的价值。但是我们发现,无论是与LVEF及心功能相关性的程度,还是在诊断心衰的敏感性、特异性,miR-182均不占优势,这与Cakmak等[18]的研究结果并不一致。还需要更大样本的研究进一步验证。

总之,血浆miR-182表达水平对老年慢性心衰病人的诊断及预后评价具有一定的临床意义。与NT-proBNP相比较,miR-182同样受年龄、肾功能、Hb、白蛋白影响,且特异性、敏感性不如NT-proBNP。但我们也认识到,本研究受样本数量较少、年龄跨度较大、未跟踪随访等因素影响,可能导致本研究结论不全面,故今后尚需扩大研究样本量,并进行跟踪随访深入研究进一步证实。